Kalprotektyna to białko cytoplazmatyczne z rodziny S100. Należy do białek ostrej fazy. Jest obecna we wszystkich komórkach organizmu. W największych ilościach występuje w cytoplazmie neutrofili i w błonach komórkowych monocytów. Kalprotektyna stanowi blisko połowę białek cytoplazmatycznych występujących w ciele człowieka. Jej stężenie koreluje ze wzrostem stanu zapalnego w organizmie, dlatego wykorzystuje się ją w diagnostyce wielu chorób. Wysoki poziom kalprotektyny w surowicy krwi występuje w przebiegu chorób reumatycznych, w mukowiscydozie, w infekcjach płuc, w ostrym zapaleniu trzustki, a także u pacjentów gastroenterologicznych.
1. Historia odkrycia kalprotektyny
Kalprotektyna została odkryta w 1980 roku przez norweskich naukowców Magne K. Fagerhol, Inge Dale i Terje Anderson. Prowadzili oni badania nad granulocytami. Odkryty związek nazwali białkiem leukocytowym 1 (L1). W 1987 roku Dorin i wsp. opisali jego sekwencję aminokwasową. W tym samym roku Odink i wsp. wykazali, że białka zdolne do wiązania wapnia ulegają ekspresji w makrofagach podczas przewlekłych stanów zapalnych. Zmienili nazwę białka L1 na kalprotektynę. [1]
W 1990 roku Steinbakk i wsp. zauważyli, że kalprotektyna ma właściwości hamujące rozrost grzybów Candida spp. i Cryptococcus neoformans oraz bakterii Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Escherichia coli oraz Klebsiella spp. W latach 90. XX wieku trwały badania nad określeniem występowania kalprotektyny w organizmie człowieka. [1] Obecnie dąży się do poznania wszystkich właściwości tego białka.
2. Właściwości kalprotektyny
Kalprotektyna ma niską masę cząsteczkową. [4] Zbudowana jest z łańcuchów polipeptydowych o masie 8,2 kD i 13,3 kD, które tworzą strukturę podwójnej helisy i posiadają miejsce wiążące jony wapnia, cynku i manganu. Każdy z peptydów może przyłączyć 2 jony. Kalprotektyna składa się z dwóch podjednostek tworzących kompleks heterodimeru: S100A8 i S100A9 (MRP8/MRP14). [1]
Geny podjednostek kalprotektyny, znane jako S100A8 i S100A9, znajdują się na chromosomie 1q21. [8] Receptorem odpowiedzialnym za transdukcję sygnału indukującego wydzielanie kalprotektyny jest receptor toll-podobny 4 (ang. tool-like receptor 4, TLR-4) [4] Syntezę kalprotektyny blokują glikokortykosteroidy. [6]
W warunkach fizjologicznych poziom kalprotektyny w osoczu krwi nie przekracza 6 mg/L. W kale jej stężenie jest kilkukrotnie wyższe. Kalprotektyna jest uwalniana w odpowiedzi na uszkodzenie tkanek i stan zapalny. Czas półtrwania kalprotektyny w surowicy krwi wynosi około 5 godzin [6], a w kale nawet do 7 dni. [2] Związane jest to z możliwością przyłączania jonów wapnia, co czyni ją bardzo odporną na degradację proteolityczną. [1]
2.1. Kalprotektyna w osoczu krwi
W diagnostyce schorzeń oddechowych, nefrologiocznych czy też metabolicznych wykorzystuje się kalprotektynę pobraną z osocza krwi. Jednocześnie analizie podlegają inne markery stanu zapalnego, jak białko C-reaktywne (CRP), odczyn Biernackiego (OB), poziom białka wiążącego heparynę (ang. heparin binding protein, HBP) czy prokalcytonina (PCT). [8]
2.2. Kalprotektyna w kale
Badania kalprotektyny z kału stosuje się w diagnostyce chorób zapalnych jelit. Białko to jest stabilne i odporne na działanie enzymów oraz produktów przemiany materii. W oznaczaniu poziomu kalprotektyny w kale wykorzystuje się metody ilościowe, jakościowe i mieszane. [8]
U zdrowych osób w dorosłym wieku stężenie kalprotektyny w kale nie powinno przekraczać 50 µg/g. Im wyższy poziom kalprotektyny, tym większe nasilenie zapalenia wewnątrz jelit. Wyniki powyżej 800 µg/g są wskazaniem do natychmiastowego leczenia lub hospitalizacji. Natomiast u dzieci fizjologicznie występuje wyższe stężenie kalprotektyny w kale. Wynika to m.in. z niedojrzałości śluzówki jelita i kształtowania się mikrobioty. [8]
3. Wpływ na układ odpornościowy
Zdolności kalprotektyny do wiązania jonów wapnia i cynku wiążą się z jej właściwościami bakteriostatycznymi i grzybobójczymi. [2] Właściwości bakteriobójcze kalprotektyny wynikają z hamowania rozprzestrzeniania się bakteryjnych metaloproteinaz, aktywowania migracji neutrofili do miejsca objętego stanem zapalnym oraz uruchamiania procesów fagocytozy. Kalprotektyna blokuje działanie enzymów zależnych od cynku i dzięki temu niszczy bakterie. Dodatkowo indukuje apoptozę, co sprzyja usuwaniu zbędnych i uszkodzonych komórek. [6]
Kalprotektyna pełni funkcję czynnika chemotaktycznego. Czynniki chemotaktyczne odgrywają bardzo ważną rolę w miejscowym procesie zapalnym, przyciągając komórki układu odpornościowego do miejsca zakażenia. [3] Kalprotektyna stymuluje aktywność neutrofili oraz produkcję interleukiny 8 (IL-8). [6] Dodatkowo wzmacnia syntezę immunoglobulin. Bierze udział w procesie aktywnej śmierci komórki stymulowanej przez neutrofile (ang. neutrophil extracellular trap, NET). Mechanizm ten polega na rozszczelnieniu błony komórkowej neutrofili oraz dekondensacji DNA w reakcji na zakażenie. W efekcie dochodzi do uwolnienia zawartości cytoplazmy, m.in. kalprotektyny, do przestrzeni pozakomórkowej. Tworzy się swego rodzaju pułapka dla komórek bakteryjnych, grzybów czy wirusów, które w ten sposób są wyłapywane i eliminowane. [2] Ponadto kalprotektyna reguluje wewnątrzkomórkową aktywność głównego źródła reaktywnych form tlenu, czyli oksydazy NADPH, w neutrofilach. [8]
Kalprotektyna jest kompleksem dwóch podjednostek, stabilizowanym przez wapń. To ta postać jest oznaczana w badaniach.
4. Rola kalprotektyny w diagnostyce chorób nerek
Badania na myszach wskazują, że kalprotektyna jest wytwarzana w odpowiedzi na epizody niedokrwienia i reperfuzji, czyli powracania przepływu krwi w niedokrwionym narządzie. U gryzoni z niedoborem kalprotektyny i jej obniżoną aktywnością obserwowano większą częstotliwość włóknienia nerek w odpowiedzi na epizod niedokrwienia w porównaniu z myszami o prawidłowej ekspresji tego białka. Prawdopodobnie jest to spowodowane zwiększonym wytwarzaniem makrofagów typu M2 w uszkodzonej nerce. [4] Makrofagi tego typu pełnią najważniejszą funkcję w procesach naprawy tkanki i pobudzają produkcję limfocytów pomocniczych w odpowiedzi na stres oksydacyjny. [5]
Wzrost poziomu kalprotektyny obserwuje się w przypadku zakażeń układu moczowego, przy ropomoczu i raku urotelialnym oraz w przewlekłych chorobach nerek. Kalprotektyna jest również wykorzystywana jako marker diagnostyczny przy podejrzeniu ostrego uszkodzenia nerek (ang. acute kidney injury, AKI). Jej poziom gwałtownie wzrasta do 2 godzin po niedokrwieniu narządu. W przypadku nerek przeszczepionych przydatność kalprotektyny jako markera diagnostycznego jest jednak istotnie mniejsza. Wpływają na to stosowane przez pacjentów leki immunosupresyjne, które zmieniają działanie układu immunologicznego. [4]
5. Kalprotektyna a wysiłek fizyczny
Wysiłek fizyczny powoduje zwiększenie stężenia kalprotektyny w osoczu krwi. U maratończyków poziom kalprotektyny może wzrosnąć nawet 96-krotnie. Natomiast krótki lecz intensywny wysiłek fizyczny powoduje jedynie 3-krotny skok jej stężenia. Zmiany te odzwierciedlają stopień uszkodzenia tkanek i śródbłonka naczyń, prowadzących do mikroskrzepów, a w efekcie do aktywacji neutrofili. Neutrofile fagocytują płytki krwi w miejscach narażonych na mikrozakrzepy, dzięki czemu zapobiegają rozwojowi zakrzepicy. Zawartość kalprotektyny w neutrofilach pozostaje niezmieniona podczas ćwiczeń na umiarkowanym poziomie i wynosi średnio 25 pg/komórkę. [6]
6. Kalprotektyna jako marker stanu zapalnego jelit
Kalprotektyna jest markerem stanu zapalnego jelit. Podczas stanu zapalnego do światła jelita napływają neutrofile. We wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego (WZJG) oraz w chorobie Leśniowskiego-Crohna następuje 10-krotnie zwiększona migracja neutrofili z krążenia ogólnego do miejsca zmienionego zapalnie. W miejscu stanu zapalnego neutrofile uwalniają kalprotektynę. Wzrost stężenia tego białka w kale jest fizjologiczną odpowiedzią na uszkodzenie błony śluzowej jelita. U pacjentów będących w remisji jej ilość w stolcu zmniejsza się. Jednak u osób z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego w okresie remisji poziom kalprotektyny w kale jest niższy niż u pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna w okresie wyciszenia choroby. Dodatkowo zauważa się korelację pomiędzy stężeniem kalprotektyny w kale a aktywnością chorób zapalnych jelit. [8]
Oznaczanie tego biomarkera w kale pomaga również w różnicowaniu organicznych przyczyn biegunek i diagnostyce zespołu jelita drażliwego. U pacjentów z chorobami zapalnymi jelit dochodzi do rozszczelnienia bariery jelitowej i do nasilonego przenikania leukocytów przez nabłonek, co w konsekwencji prowadzi do zwiększonego uwalniania kalprotektyny do kału. Niskie stężenie kalprotektyny z dużym prawdopodobieństwem wyklucza choroby zapalne jelit i wskazuje na inną przyczynę dolegliwości. [8]
Oznaczenie w kale rozróżnia chorobę zapalną jelit od zaburzeń czynnościowych i pozwala monitorować leczenie.
7. Rola kalprotektyny w diagnostyce chorób układu oddechowego
Kalprotektyka jest biomarkerem w diagnostyce ostrych infekcji dróg oddechowych. Podczas pandemii COVID-19 zauważono jej znaczącą rolę w rozwoju ciężkiego przebiegu zakażenia koronawirusem. Kalprotektyna odzwierciedla stopień aktywacji neutrofili i bierze udział w burzy cytokinowej. Wzrost jej stężenia w osoczu koreluje z potrzebą zastosowania wentylacji mechanicznej u pacjentów chorych na COVID-19, a także u osób w przebiegu posocznicy. W trakcie infekcji SARS-CoV-2 zwiększa się również poziom kalprotektyny w kale, nie zauważa się jednak nasilenia objawów ze strony przewodu pokarmowego. [8]
Oznaczenie stężenia kalprotektyny wraz z poziomem białka C-reaktywnego w osoczu krwi jest użyteczne u chorych na mukowiscydozę. W idiopatycznym włóknieniu płuc również stwierdza się podwyższone osoczowe wartości kalprotektyny. Jej stężenie koreluje ze zdolnością płuc do usuwania tlenku węgla, co sprawia, że jest ona skutecznym narzędziem w monitorowaniu przebiegu choroby. Oznaczania kalprotektyny z krwi znacznie ułatwia różnicowanie chorób płuc. Może się to również przełożyć na stworzenie nowych algorytmów co do konieczności stosowania antybiotykoterapii. [8]
8. Rola kalprotektyny w diagnostyce zapalenia stawów
Kalprotektyna jest biomarkerem wykorzystanym w diagnostyce reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS). W porównaniu do innych czynników zapalnych, m.in. białka C-reaktywnego czy OB, skuteczniej weryfikuje obecność stanu zapalnego w błonie maziowej. Ma to znaczenie w monitorowaniu stanu zdrowia chorych na RZS i może pomóc w ocenie odpowiedzi na leczenie. [8]
Istnieje silna korelacja pomiędzy stężeniem kalprotektyny a ekspresją innych chorób. Kalprotektyna może być ona wykorzystywana w diagnostyce różnicowej m.in. choroby Stilla, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, łuszczycowego zapalenia stawów, pierwotnego zespołu Sjögrena, a także w młodzieńczym idiopatycznym zapaleniu stawów, chorobie Behçeta, polimialgii reumatycznej i układowym toczniu rumieniowatym. Dodatkowo powiązanie osoczowego stężenia kalprotektyny ze zmianami zapalnymi stawów pozwala na monitorowanie ryzyka zapalenia okołoprotezowego po całkowitej endoprotezoplastyce stawu kolanowego i biodrowego. [8]
9. Rola kalprotektyny w zapaleniu naczyń związanych z ANCA
Zapalenie naczyń związane z przeciwciałami przeciw antygenom cytoplazmy neutrofili (ang. anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA) to schorzenie, w którym stwierdza się obecność w surowicy krwi przeciwciał skierowanych przeciw antygenowi cytoplazmatycznemu neutrofili i monocytów. W przebiegu choroby występuje stan zapalny w ścianie naczynia. Obraz kliniczny zależy od stopnia zajęcia naczynia. [9] W patogenezie choroby obserwuje się uwalnianie znacznej ilości kalprotektyny. Jest to związane z niszczeniem neutrofili. Osoczowe stężenie kalprotektyny w istotny sposób koreluje z występowaniem białkomoczu, w związku z czym białko to jest skutecznym narzędziem do monitorowania minimalnej aktywności choroby już w trakcie terapii immunosupresyjnej. Pozwala także na identyfikację chorych, u których konieczna jest intensyfikacja terapii. [8]
10. Rola kalprotektyny w chorobach tarczycy
W ostatnich latach wzrasta zainteresowanie kalprotektyną w kontekście chorób tarczycy. Jej podwyższone stężenie koreluje z wartościami białek ostrej fazy w podostrym zapaleniu tarczycy. Wysokie wartości kalprotektyny w osoczu krwi występują w chorobie Gravesa-Basedowa (autoimmunologicznym zapaleniu tarczycy). Kalprotektyna bierze udział w patogenezie orbitopatii w przebiegu tej choroby. W fibroblastach oczodołowych dochodzi bowiem do nasilenia ekspresji mRNA dla kalprotektyny. [8]
Białko wiąże cynk i mangan, pozbawiając bakterie pierwiastków niezbędnych do wzrostu. Działa więc przez sekwestrację metali.
11. Rola kalprotektyny w chorobach metabolicznych
W ostatnich latach zauważa się istotną rolę kalprotektyny w przebiegu chorób metabolicznych, w tym w otyłości. Stężenie kalprotektyny w osoczu krwi koreluje z podwyższoną masą ciała, białko to może być więc jednym z biomarkerów zapalenia związanego z otyłością. Obecność przewlekłego stanu zapalnego odpowiada zaś za powstawanie powikłań metabolicznych. [8]
Otyłości i innym chorobom metabolicznym towarzyszy zwiększone uwalnianie cytokin, m.in. czynnika martwicy nowotworów (TNF-alfa), interferonu (IFN-gamma) i interleukin (IL-1-beta, IL-6 i IL-12). Nasilona ekspresja TNF-alfa, IL-1-beta oraz IL-6 w tkance tłuszczowej prowadzi do zablokowania reakcji komórek na insulinę. Stan ten nazywany jest insulinooopornością. Nieleczona insulinooporność prowadzi do cukrzycy typu 2 i rozwoju zespołu metabolicznego. U osób chorych w tkance tłuszczowej trzewnej obserwowany jest wzrost liczby makrofagów i neutrofili. W przebiegu chorób związanych z zapaleniem metabolicznym, takich jak cukrzyca typu 2, dna moczanowa czy otyłość dochodzi do przyrostu kalprotektyny w surowicy krwi, następuje również nasilenie ekspresji tego białka w miejscach stanu zapalnego. Za pośrednictwem receptorów TLR4 obecnych w tkance tłuszczowej kalprotektyna zwiększa uwalnianie IL-1-beta w makrofagach. Ponadto w przebiegu dny moczanowej substancje takie jak moczany monosodowe stymulują neutrofile i makrofagi do większego wydzielania białek S100A8/A9. Sama kalprotektyna podtrzymuje stan zapalny poprzez chemotaktyczne działanie na makrofagi oraz aktywację wydzielania cytokin prozapalnych, przez co również wpływa na rozwój chorób związanych z otyłością. [1]
12. Rola kalprotektyny w nowotworzeniu
Kalprotektyna bierze udział w procesach apoptozy, proliferacji i różnicowania komórek, również tych nowotworowych. [15] Naukowcy wskazują, że ekspresja tego białka może mieć działanie przeciwnowotworowe. Badania in vitro na ludziach i zwierzętach potwierdzają, że kalprotektyna indukuje apoptozę w komórkach pochodzących z guzów nowotworowych. Jej aktywność wzrasta u pacjentów z różnymi rodzajami chorób nowotworowych. Białko to powoduje wzrost ekspresji genów związanych z apoptozą w przypadku m.in. raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. [16] Zbliżone wyniki uzyskano w przypadku komórek gruczolakoraka żołądka, na które kalprotektyna działała cytotoksycznie oraz stymuluje ich apoptozę. [17] Badania in vivo nie potwierdziły jednak tego mechanizmu, a nawet sugerują, że białko to może sprzyjać nowotworzeniu. [18]
Przykładem takiego działania może być wiązanie kalprotektyny z receptorami RAGE komórek raka okrężnicy. Prowadzi to do aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-κB i proliferacji komórek nowotworowych. [13] Do zwiększonej ekspresji kalprotektyny dochodzi również w raku piersi. Dodatkowo zauważa się silny związek pomiędzy aktywnością receptora RAGE i złym rokowaniem u pacjentek. Dodatkowo kalprotektyna inicjuje ścieżkę sygnałową S100A8/A9-RAGE-FAK-YAP, która uczestniczy we wzroście guza. Kinaza ogniskowo-adhezyjna (ang. focal adhesion kinase, FAK) bierze udział w przyleganiu komórek nowotworowych do nabłonka oraz nasila przerzuty. Natomiast białko powiązane z białkiem Yes (ang. yes-associated protein, YAP) jest promotorem transkrypcji genów biorących udział w proliferacji komórek. [14]
Kalprotektyna wraz z czynnikami wzrostu oraz cytokinami i chemokinami, za pośrednictwem receptora CD33, oddziałuje na powstawanie i rozprzestrzenianie się mieloidalnych komórek supresorowych (ang. myeloid-derived suppressor cells, MDSC). Komórki te hamują działanie cytotoksycznych limfocytów T oraz indukują limfocyty T supresorowe, upośledzają tym samym przeciwnowotworowe działanie limfocytów cytotoksycznych. Dodatkowo indukują angiogenezę, w efekcie czego wpływają na wzrost nowotworu. [12]
Kalprotektyna może mieć różny wpływ na rozwój choroby nowotworowej w zależności od stężenia oraz działania wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowego. Kalprotektyna występująca zewnątrzkomórkowo w niskich stężeniach stymuluje proliferację komórek nowotworowych oraz ich migrację. [10] Natomiast działając wewnątrzkomórkowo zwiększa ekspresję genów dla białek odpowiedzialnych za ograniczanie rozwoju raka. [11] Mechanizm działania kalprotektyny w patogenezie chorób nowotworowych związany jest ze stanami zapalnymi. Obecne w miejscu zapalenia cytokiny prozapalne, takie jak TNF-alfa czy IL-6 oraz czynniki wzrostu mają działanie mitogenne sprzyjające nowotworzeniu i niszczeniu DNA. Ponadto kalprotektyna za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego NF-κB zwiększa ekspresję genów, których produkty odgrywają rolę w gojeniu ran, angiogenezie oraz przerzutach nowotworowych. [10]