Kalmodulina

Kalmodulina (ang. calcium-modulated protein, CaM) to niewielkie białko modulatorowe, odpowiedzialne za prawidłowe funkcjonowanie i przeżycie komórek. Kalmodulina wiąże jony wapnia wewnątrz siateczki śródplazmatycznej i odpowiada za utrzymywanie równowagi wapniowej w komórce. Uczestniczy także w tworzeniu szlaków sygnałowych. Kalmodulina w największej ilości występuje w tkance nerwowej. Znajduje się w cytoplazmie, jądrze komórkowym i w centrosomach, rzadziej na błonach komórkowych. Kalmodulina oddziałuje z szeregiem białek, m.in z kinazami białkowymi II (zwanymi też enzymami pamięci), fosfatazami białkowymi (np. z kalcyneuryną), z cyklazą adenylanową, z ATPazą wapniową oraz z kinazami lekkich łańcuchów miozyny. Zaburzenia w strukturze i działaniu kalmoduliny prowadzą do dysfunkcji w gospodarce wapniowej i utraty homeostazy w środowisku wewnątrzkomórkowym.

1. Historia odkrycia kalmoduliny

Kalmodulina została odkryta w 1970 roku jednocześnie przez dwa zespoły badawcze [1], prowadzone odpowiednio przez Kakiuchiego i Cheunga. Następnie Teo i Wang stwierdzili, że ma ona niski ciężar cząsteczkowy oraz że z wysokim i stałym powinowactwem wiąże wapń. [4] Początkowo nazywano ją aktywatorem białkowym ze względu na właściwości aktywujące fosfodiesterazę cAMP. Dopiero gdy okazało się, że białko to wiąże jony wapnia, występuje we wszystkich komórkach eukariotycznych oraz aktywuje wiele enzymów i protein zmieniono jego nazwę na kalmodulinę. [2] Miało to miejsce w 1979 roku. [1]

Eksperymenty prowadzone na ludzkim mózgowiu na przełomie lat 80. i 90. XX wieku wykazały, że kalmodulina tłumi fosforylację synapsyny I zależną od kinazy białkowej II (PK-C). Dało to początek badaniom nad neurosekrecją. [3] Od 1976 roku do dnia dzisiejszego badania nad kalmoduliną prowadzone są w wielu ośrodkach laboratoryjnych na świecie. [4]

2. Budowa kalmoduliny

Kalmodulina zbudowana jest ze 148 aminokwasów tworzących jeden łańcuch polipeptydowy. [1] Strukturą przypomina inne białka wiążące wapń. Jej cząsteczka jest bogata w fenyloalaninę, asparaginę i glutaminę, nie zawiera natomiast cysteiny i tryptofanu. Taki stosunek ilościowy aminokwasów kwaśnych i zasadowych powoduje, że kalmodulina ma niski punkt izoelektryczny. Charakterystyczny skład aminokwasowy tego białka sprawia, że ma ono właściwości spektralne, czyli absorbuje i odbija światło. [4]

Kalmodulina ma cztery domeny. Każda z nich zbudowana jest z dwóch ramion tworzących α-helisę oraz umiejscowionej między nimi pętli. W niej z kolei znajdują się aminokwasy koordynacyjne odpowiedzialne za wiązanie jonów wapnia. [4] W sumie białko to ma cztery miejsca wiążące wapń. Znajdują się one w dwóch domenach EF (ang. EF hands). [1]

Związanie jonów wapnia wzmacnia szkielet kalmoduliny, natomiast ich odczepienie – uelastycznia łańcuch polipeptydowy, zwiększając jego podatność na proteolizę. W proteolizie kalmoduliny bierze udział m.in. trypsyna. Proces ten prowadzi do powstania wielu fragmentów białka o niskim ciężarze cząsteczkowym. Natomiast efektem działania trypsyny na kalmodulinę zawierającą związany wapń jest podział białka na dwa fragmenty oporne na dalsze trawienie. Reszty aminokwasowe kalmoduliny zawierającej jony wapnia są niedostępne dla pozostałych czynników degradujących, chyba że działają na nie chelaty wapnia. Dochodzi wtedy do zwiększonej reaktywności reszt lizyny i tyrozyny oraz grup karboksylowych, a w konsekwencji do częściowego rozfałdowania łańcucha polipeptydowego. [4]

3. Synteza kalmoduliny

Geny dla kalmoduliny (CALM1, CALM2 i CALM3) znajdują się kolejno na chromosomach: 14, 2 i 19. [11] Wzrost ilości kalmoduliny zachodzi pod wpływem stymulacji komórki i zwiększonego napływu wapnia do cytozolu bądź nasilenia uwalniania jego jonów z retikulum endoplazmatycznego. Wapń wiąże się z kalmoduliną przekształcając ją w formę aktywną. Aktywowane białko pośredniczy w inicjacji fazy S i M cyklu komórkowego, a także reguluje aktywność genów kodujących białka związane z kontrolą cyklu komórkowego. [12]

Synteza kalmoduliny zachodzi również pod wpływem wysokiego poziomu czynników wzrostu oraz w wyniku zaburzeń termoregulacji i stanu zapalnego. [12] Zwiększenie ilości kalmoduliny powoduje inicjację syntezy tlenku azotu (NO). Chwilowy wzrost NO prowadzi do tworzenia kompleksów kalmoduliny z indukowaną izoformą syntazy tlenku azotu (iNOS). [14]

Do zahamowania powstawania kalmoduliny dochodzi natomiast w wyniku zbyt niskiego poziomu jonów wapnia i degradacji enzymatycznej. Również zmniejszenie ekspresji genów kodujących kalmodulinę może prowadzić do ograniczenia jej ilości w komórce. [12] Działanie antykalmodulinowe wykazuje zaś melatonina. [13]

4. Receptory kalmoduliny

4.1. Receptory rianodynowe

Receptory rianodynowe (RyR) to duże białka zbudowane z około pięciu tysięcy aminokwasów. Ich masa cząsteczkowa wynosi ponad 500 kDa. Receptory rianodynowe przyjmują formę tetramerów. Zbudowane są z domeny C-końcowej, domeny centralnej oraz z domeny N-końcowej. Ich aminokwasy tworzą segmenty transmembranowe. Miejsce wiązania kalmoduliny w receptorach rianodynowych znajduje się w obrębie obszarów odpowiedzialnych za procesy fosforylacji. [6]
Wyróżnia się trzy izoformy tych białek:

• receptory RyR-1 – występują na komórkach mięśni szkieletowych
• receptory RyR-2 – charakterystyczne dla mięśnia sercowego i neuronów mózgu
• receptory RyR-3 – znajdują się w komórkach nerwowych, a w mniejszej ilości – w komórkach mięśni gładkich [6]

Receptory rianodynowe mają właściwości kanałów wapniowych. Uwalniają jony wapnia z retikulum sarkoplazmatycznego w komórkach mięśniowych i z retikulum endoplazmatycznego komórek nerwowych. [7] Połączenie kalmoduliny z receptorem rianodynowym prowadzi do zamknięcia kanałów wapniowych i zahamowania wnikania jonów wapnia do komórki. [8]

4.2. Receptory IP3

Receptory IP3 są białkami o niskiej masie cząsteczkowej (230-260 kDa). Każdy receptor zbudowany jest z 2600-2800 reszt aminokwasowych. Receptory IP3 posiadają następujące domeny:

• domena C-końcowa
• domena centralna
• domena N-końcowa [6]

Na C-końcu łańcucha polipeptydowego znajdują się aminokwasy o właściwościach hydrofobowych. Tworzą one od 4 do 12 segmentów transmembranowych. Domena C-końcowa stanowi około 10% całej cząsteczki białka IP3. Natomiast region N-końcowy zbudowany jest z 576 aminokwasów i odgrywa rolę regionu regulatorowego. Domena ta charakteryzuje się miejscem wiązania wapnia i kalmoduliny, uczestniczących w regulacji aktywności kanału białkowego. Centralnie położona domena regulatorowa zbudowana jest z największej ilości aminokwasów. Ma na swojej powierzchni miejsca ulegające fosforylacji w obecności kinaz, a także rejony wiążące jony wapnia i kalmodulinę. [6]

Receptory IP3 umiejscowione są na retikulum endoplazmatycznym oraz po obu stronach otoczki jądrowej. Wyróżnia się trzy izoformy tych białek: IP3-R1, IP3-R2 i IP3-R3. Receptory IP3-R1 występują głównie w układzie nerwowym. Natomiast izoformy IP3-R2 i IP3-R3 umiejscowione są w pozostałych tkankach. Największe powinowactwo do kalmoduliny wykazują izoformy IP3-R1 i IP3-R2. W jednym typie komórki może występować wiele izoform tego białka. [6]

4.3. Kinaza II zależna od kalmoduliny

Kinazy białkowe to nadrodzina białek należących do fosfotransferaz. Kodowane są przez 1,7% wszystkich ludzkich genów. Odgrywają kluczową rolę w podziałach komórkowych, różnicowaniu komórek czy w procesach apoptozy. Zbudowane są z 250-300 reszt aminokwasowych. Białka te mają dwa płaty: N-terminalny i C-terminalny. Natomiast w centralnym miejscu leży region zawiasowy. Płat N-terminalny składa się z pięciu β-wstążek (β1-β5) i jednej α-helisy (αC). Natomiast płat C-terminalny zbudowany jest głównie z α-helis. Kinaza II zawiera także dwanaście subdomen o różnych funkcjach. [9]

Kinaza II zależna od kalmoduliny występuje w tkance nerwowej. Może mieć formę frakcji rozpuszczalnej lub stałej, połączonej z błoną komórkową czy też z elementami cytoszkieletu. Główną funkcją kinazy II jest przyłączanie reszt fosforanowych do innych białek, co prowadzi do zmian syntezy i uwalniania neurotransmiterów. [2] Usunięcie reszty fosforanowej wymaga hydrolizy wiązania estrowego. Proces ten katalizowany jest przez fosfatazy białkowe. [9] Pod wpływem kalmoduliny dochodzi do autofosforylacji kinazy II i zmiany jej struktury. [2]

4.4. Kalcyneuryna

Kalcyneuryna należy do grupy białek zwanych fosfatazami. Jej masa cząsteczkowa wynosi 79 kDa. Zbudowana jest z podjednostki katalitycznej wiążącej kalmodulinę i z podjednostki regulatorowej wiążącej wapń. Do głównych funkcji kalcyneuryny należą regulacja homeostazy wapnia i udział w reakcji utleniania-redukcji (tzw. reakcji redoks) w komórce. [2] Aktywowana przez kalmodulinę kalcyneuryna przemieszcza się dwukierunkowo przez błonę jądrową i defosforyluje czynnik jądrowy aktywowanych komórek T (ang. nuclear factor of activated T-cells, NFAT). W efekcie ulega on translokacji do jądra komórkowego, gdzie wpływa na ekspresję szeregu genów. [5]

Aktywność kalcyneuryny jest hamowana przez kompleksy leków immunosupresyjnych z odpowiednimi białkami (np. przez kompleks cyklosporyny z cyklofiliną). Powodują one tzw. efekt immunosupresyjny, polegający na zahamowaniu wytwarzania limfocytów T i zmniejszeniu syntezy interleukiny II. Kalcyneuryna jest także inaktywowana przez dysmutazę ponadtlenkową. Degradację tego białka hamuje kwas askorbinowy. [2]

4.5. Białka szoku cieplnego wiążące kalmodulinę

Białka szoku cieplnego (ang. (heat shock proteins, HSPs) to duża rodzina polipeptydów o zbliżonej strukturze aminokwasowej. Wykazują aktywność cytoochronną i są białkami opiekuńczymi dla innych cząsteczek. Są syntetyzowane głównie w odpowiedzi komórki na stres. Do białek szoku cieplnego wiążących kalmodulinę należą HSP70 i HSP90. Białka te mają pierwszorzędową strukturę i zbudowane są z trzech domen: N-końcowej, środkowej i C-końcowej. Miejsce wiązania kalmoduliny znajduje się na końcu N łańcucha polipeptydowego. [10]

Oddziaływanie kalmoduliny z białkami HSP prowadzi do szeregu zmian w komórce. Jedną z głównych funkcji tych białek jest zachowanie homeostazy komórek i ich ochrona w momencie narażenia na stres oksydacyjny. Związanie kalmoduliny przez HSP wpływa na zmianę szlaków sygnałowych związanych z odpowiedzią na stres, co może mieć znaczenie dla zdolności komórek do przeżycia w trudnych warunkach. Ponadto białka szoku cieplnego chronią kalmodulinę przed denaturacją w wyniku działania wysokich temperatur, warunkując zachowanie jej funkcji regulacyjnych. [10]

5. Funkcje kalmoduliny

5.1. Wpływ kalmoduliny na układ nerwowy

Kompleks kalmodulina-wapń reguluje aktywność układu nerwowego, m.in. pracę układu glutaminergicznego. Sprzyjając uwalnianiu czynników transkrypcyjnych, wpływa na ekspresję genów związanych z aktywnością receptorów glutaminergicznych. Kwas glutaminowy odgrywa rolę mediatora synaptycznego, pełni również istotną funkcję w procesach plastyczności neuronalnej. Pobudzenie jonotropowych receptorów glutaminianergicznych powoduje napływ jonów wapnia do komórki nerwowej, a w efekcie aktywację kinaz białkowych i wzrost poziomu kalmoduliny. Nadmierne wydzielanie kwasu glutaminowego jest cytotoksyczne dla komórek nerwowych. Natomiast zbyt duży napływu jonów wapnia do neuronów aktywuje enzymy odpowiedzialne za rozpad kalmoduliny i innych białek zaangażowanych w utrzymanie homeostazy układu nerwowego. Prowadzi to do uszkodzenia mitochondriów i śmierci komórek nerwowych. [14]

5.2. Udział w biosyntezie tlenku azotu

Kalmodulina jest jednym z kofaktorów w reakcji powstawania tlenku azotu. Tlenek azotu to nieorganiczny związek chemiczny, który bierze udział w ośrodkowej i obwodowej regulacji ciśnienia tętniczego, hamuje adhezję i agregację płytek krwi i leukocytów, blokuje patologiczną proliferację komórek śródbłonka, a także uczestniczy w modulacji przepływu krwi w wielu narządach. W ośrodkowym układzie nerwowym NO pełni funkcję neuroprzekaźnika i neuromodulatora. Do jego zadań należy m.in. przekazywanie informacji pomiędzy komórkami i wewnątrz nich. [15]

Kalmodulina inicjuje także powstawanie enzymu katalizującego syntezę NO. Jest nim syntaza tlenku azotu. Jej izoenzymy są zależne od kompleksu kalmodulina-wapń. Na aktywację poszczególnych izoform syntazy tlenku azotu wpływa poziom wapnia wewnątrz komórki. Im wyższa ilość jonów wapnia, tym większe stężenie NO. Jego nadmiar jest jednak toksyczny. Do hiperaktywności tlenku azotu prowadzi zbyt wysoki poziom jonów wapnia. Te z kolei gromadzą się w komórkach podczas narażenia tkanek na stan zapalny. W stanach patologicznych, którym towarzyszy podwyższone stężenie wolnych jonów wapnia i NO, kalmodulina chroni komórki przed uszkodzeniami. [15]

5.3. Wpływ kalmoduliny na układ kostno-szkieletowy

Kalmodulina, wraz z melatoniną i osteoprotegeryną, wpływa na prawidłowy rozwój układu szkieletowego. W przypadku chorób idiopatycznych związanych z nieprawidłową strukturą kośćca dochodzi do zwiększenia poziomu kalmoduliny płytkowej i kalmoduliny w bioptatach mięśni przykręgosłupowych w miejscu objętym schorzeniem. Dodatkowo kalmodulina ma bezpośredni wpływ na gospodarkę wapniowo-fosforanową organizmu, co czyni ją potencjalnym czynnikiem ryzyka w powstawaniu młodzieńczej skoliozy. Związki o działaniu antagonistycznym do kalmoduliny, np. tamoksyfen czy melatonina, również mogą wpływać na deformację kręgosłupa poprzez zmianę napięcia mięśni przykręgosłupowych. [13]

Istotne znaczenie w rozwoju chorób układu szkieletowego mogą mieć również oddziaływania pomiędzy kalmoduliną a estrogenami i innymi hormonami wydzielania wewnętrznego. Odpowiednie stężenia kalmoduliny i wapnia są niezbędne do prawidłowego działania receptorów estrogenowych. Te z kolei odpowiadają za metabolizm estrogenów w tkance kostnej. Nieprawidłowy stosunek kalmoduliny do estrogenów skutkuje zaburzoną mineralizacją poszczególnych regionów szkieletu i obniżeniem szczytowej masy kostnej, a w konsekwencji – schorzeniami tego układu. [13]

5.4. Wpływ kalmoduliny na gospodarkę wapniową

Kalmodulina jest inhibitorem w procesie uwalniania wapnia z retikulum endoplazmatycznego w komórkach. Zmniejsza częstość otwierania się kanałów zależnych od receptorów rianodynowych i receptorów IP3. Kalmodulina wchodzi w bezpośrednią interakcję z receptorem, w efekcie czego dochodzi do zmiany jej stężenia i do nasilonego uwalniania jonów wapnia w obecności ATP. [6]

5.5. Udział kalmoduliny w procesach enzymatycznych

Kalmodulina uczestniczy w syntezie i uwalnianiu wielu enzymów. Należą do nich m.in. białka biorące udział w metabolizmie cyklicznych nukleotydów oraz kinazy, których aktywność zależy od stężenia jonów wapnia. [4]

Kalmodulina wchodzi w skład m.in. kompleksu fosfodwuesterazy zależnej od jonów wapnia i aktywuje cyklazę adenylanową. Pod wpływem zwiększenia ilości jonów wapnia w komórce aktywuje syntezę cAMP, jak i hydrolizę cAMP i cGMP. W ten sposób reguluje poziom cyklicznych nukleotydów. Działanie kalmoduliny w procesach enzymatycznych jest uwarunkowane obecnością wapnia. [4]