Kalmodulina

1. Charakterystyka białka

1.1. Definicja i przynależność

Kalmodulina (ang. calmodulin, CaM) to małe białko regulatorowe wiążące jony wapnia, należące do nadrodziny białek z motywem „ręki EF” [1]. Ręka EF (ang. EF-hand) to układ helisa–pętla–helisa, w którym pętla chwyta jeden jon wapnia [2]. Ludzka kalmodulina składa się ze 148 aminokwasów [3], a jej masa wynosi około 17 kDa [4]. Jest białkiem wszechobecnym i w komórce znajduje się zarówno w cytoplazmie, jak i w jądrze [4]. W sygnalizacji wapniowej pełni funkcję głównego czujnika, czyli przekłada wzrost stężenia wapnia, jednego z przekaźników wtórnych, na zmianę aktywności białek docelowych [5].

Kalmodulina bywa mylona z innymi białkami wiążącymi wapń, choć różni się od nich rolą w przekazywaniu sygnału. Troponina C, czujnik wapnia w aparacie skurczu mięśnia poprzecznie prążkowanego, należy do tej samej rodziny białek z motywem ręki EF [2]. Od kalmoduliny odróżnia ją zakres działania: troponina C steruje jednym procesem, skurczem mięśnia poprzecznie prążkowanego, a kalmodulina może regulować ponad 300 różnych białek [1]. Parwalbuminy, kalbindyny i kalretynina również wiążą wapń, ale ich udokumentowaną funkcją jest buforowanie, czyli kształtowanie czasu trwania i zasięgu przejściowego wzrostu stężenia wapnia [6]. Dla niektórych z nich dopuszcza się dodatkowo rolę czujnika, ale nie jest ona ich główną udokumentowaną funkcją [6]. Białka S100 i neuronalne czujniki wapnia należą do tej samej nadrodziny co kalmodulina, lecz rozpoznają w dużej mierze inny zestaw białek docelowych [1]. W zakończeniu nerwowym samo zlanie pęcherzyka z błoną uruchamia synaptotagmina, białko o niskim powinowactwie do wapnia. Kalmodulina, której powinowactwo jest wysokie, działa na wcześniejszych etapach wydzielania, takich jak transport i przygotowanie pęcherzyków [7].

Od kalmoduliny odróżnia się też enzymy, które od niej odbierają sygnał, choć ich nazwy od niej pochodzą. Kalcyneuryna to fosfataza białkowa regulowana przez kompleks wapnia z kalmoduliną [8]. Kinazy CaMK tworzą rodzinę kinaz białkowych uruchamianych przez ten sam kompleks [9]. Zakres pojęcia obejmuje jedno białko o stałej sekwencji, kodowane u człowieka przez trzy geny, oraz jego dwa stany: postać związaną z wapniem i postać wolną od wapnia, zwaną apokalmoduliną [10, 11]. Białka docelowe należą do szlaków, które kalmodulina reguluje, a nie do samego pojęcia. Przez kalmodulinę jeden jon wpływa na skurcz mięśni gładkich, pobudliwość neuronów i syntezę tlenku azotu [12–14]. Mutacje jej genów wywołują zagrażające życiu zaburzenia rytmu serca, co nadaje temu białku znaczenie kliniczne [11].

1.2. Budowa i geny

Cząsteczka kalmoduliny składa się z dwóch zwiniętych płatów, N-końcowego i C-końcowego, z których każdy zawiera dwie ręce EF i wiąże dwa jony wapnia [15, 16]. Płaty łączy odcinek, który w wolnym białku tworzy centralną helisę, a w kompleksie z białkiem docelowym rozwija się w zgięcie między resztami 73 i 77 [17]. Płaty różnią się powinowactwem do wapnia: płat C wiąże go około sześciokrotnie silniej niż płat N [16]. W obrębie każdego płata wiązanie jest kooperatywne, czyli przyłączenie pierwszego jonu ułatwia przyłączenie drugiego [16]. Między płatami takiego sprzężenia nie stwierdzono, a rozdzielone płaty zachowują właściwości, jakie mają w całej cząsteczce [16]. Kalmodulina składa się więc z dwóch niemal niezależnych czujników o różnej czułości.

Wiązanie wapnia zmienia kształt obu płatów. W apokalmodulinie głęboka kieszeń hydrofobowa każdego płata pozostaje zamknięta, a kąty między helisami rąk EF różnią się od kątów w postaci z wapniem o 36–44 stopnie [15]. Przyłączenie wapnia rozsuwa helisy i odsłania tę kieszeń, niezbędną do rozpoznania białka docelowego [15]. Zmiana struktury drugorzędowej obejmuje przy tym niewielką część cząsteczki, bo z odcinka nieuporządkowanego w helisę przechodzi wtedy 7–8 ze 148 reszt aminokwasowych [18]. Apokalmodulina nie jest przy tym sztywna: w symulacjach dynamiki molekularnej przyjmowała chwilowo także kształty zbliżone do postaci z wapniem, a wapń ograniczał tę ruchliwość [18]. Otwarcie kieszeni jest zatem właściwym sygnałem wyjściowym kalmoduliny, bo bez niego białko docelowe nie zostaje rozpoznane.

U człowieka kalmodulinę kodują trzy geny, CALM1, CALM2 i CALM3, położone na trzech różnych chromosomach [19]. Wszystkie trzy wytwarzają białko o identycznej sekwencji aminokwasów, więc kalmodulina nie ma izoform w ścisłym znaczeniu [20]. Geny różnią się natomiast odcinkami mRNA nieulegającymi translacji i sekwencjami promotorów [21]. Odcinki te są silnie zachowane u ssaków, także u waleni, co wskazuje na ich udział w lokalizacji lub regulacji mRNA [21, 22]. Sama sekwencja białka jest ewolucyjnie wyjątkowo stała, a geny CALM należą do genów najmniej tolerujących zmiany w ludzkim genomie [19]. Warianty sekwencji są źle tolerowane i często wiążą się z ciężkim obrazem klinicznym [19].

1.3. Rozmieszczenie tkankowe i komórkowe

Kalmodulina występuje w cytoplazmie, w jądrze komórkowym i przy błonach, a jej położenie wewnątrz komórki zależy od typu tkanki i stanu czynnościowego. W wątrobie szczura barwienie przeciwciałami wykazało ją w cytoplazmie, w jądrze i w błonie komórkowej, przy czym znaczna część puli cytoplazmatycznej była związana z ziarnami glikogenu [23]. W mięśniu szkieletowym szczura białko wykryto w prążku I, również w sąsiedztwie ziaren glikogenu [23]. Wskazuje to na związek z enzymami przemiany glikogenu, bo jednym z nich jest kinaza fosforylazy, która zawiera kalmodulinę jako podjednostkę [24]. W korze nadnerczy szczura podanie kortykotropiny wyraźnie zwiększało ilość kalmoduliny w jądrach komórkowych [23].

W neuronach prążkowia myszy kalmodulina znajdowała się wyłącznie w elementach neuronalnych, głównie po postsynaptycznej stronie synapsy, w zagęszczeniu postsynaptycznym i przy mikrotubulach dendrytów [25]. Część kalmoduliny komórki pozostaje związana z błonami niezależnie od obecności wapnia, a udział tej frakcji zmienia się wraz ze wzrostem i zagęszczeniem hodowli komórkowej [10]. Autorzy przeglądu interpretują tę frakcję jako możliwą postać magazynową białka [10]. Kalmodulina jest więc skupiona w miejscach, w których działają jej partnerzy, a jej przemieszczanie do jądra może przenosić sygnał hormonalny na procesy jądrowe [23].

1.4. Rys historyczny

Kalmodulinę odkryto jako czynnik pobudzający jeden enzym, zanim ustalono, że sama wiąże wapń. W 1970 roku Cheung opisał w mózgu bydlęcym białkowy aktywator fosfodiesterazy cyklicznych nukleotydów [26]. W tym samym roku Kakiuchi i Yamazaki opisali w mózgu szczura aktywność fosfodiesterazy zależną od wapnia oraz jej czynnik aktywujący [27]. W 1973 roku Teo i Wang ustalili, że aktywator fosfodiesterazy z serca bydlęcego jest białkiem wiążącym wapń [28]. Tłumaczyło to zależność enzymu od wapnia, ale białko nadal uchodziło za aktywator jednej fosfodiesterazy.

Rozstrzygnięcie przyniosła praca Brostroma i współpracowników z 1975 roku. To samo białko wiążące wapń okazało się regulatorem cyklazy adenylanowej w korze mózgu świni, czyli enzymu, który wytwarza cykliczny adenozynomonofosforan (cAMP), przekaźnik wtórny rozkładany przez fosfodiesterazę [29]. Autorzy zaproponowali, że jeden regulator zależny od wapnia steruje zarówno syntezą, jak i rozkładem cyklicznych nukleotydów [29]. W 1978 roku Cohen i współpracownicy zidentyfikowali to białko jako czwartą podjednostkę kinazy fosforylazy mięśnia szkieletowego królika [24]. Kalmodulina przestała więc być czynnikiem jednego enzymu i stała się ogólnym odbiornikiem sygnału wapniowego.

2. Działanie molekularne

2.1. Aktywacja i partnerzy wiązania

Kalmodulina działa, przyłączając się do krótkiego odcinka białka docelowego, który zwykle przyjmuje kształt helisy. Większość celów wiąże postać z wapniem i dopiero wtedy zmienia aktywność [30]. Część białek wiąże jednak apokalmodulinę i utrzymuje ją przy sobie jako stałą podjednostkę, gotową do odpowiedzi na wapń [10].

W komórce spoczynkowej stężenie wolnego wapnia jest niższe niż mikromolarne, a kalmodulina pozostaje w postaci apo [10]. Bodźcem jest wzrost stężenia wapnia w cytoplazmie, na przykład po otwarciu kanałów wapniowych. Jony obsadzają najpierw płat C, którego powinowactwo jest około sześciokrotnie wyższe niż płata N [16]. W każdym obsadzonym płacie otwiera się kieszeń hydrofobowa [15]. Następnie oba płaty obejmują helisę białka docelowego z dwóch stron. W krysztale kompleksu z fragmentem kinazy łańcucha lekkiego miozyny kalmodulina utworzyła tunel wokół helisy, a jej łącznik rozwinął się w zgięcie [17]. Między białkami powstało około 185 bliskich kontaktów, w około 80% oddziaływań van der Waalsa [17]. Rozpoznanie opiera się więc głównie na hydrofobowej powierzchni helisy, a nie na ściśle określonej sekwencji, dlatego kalmodulina wiąże wiele białek o różnych sekwencjach [5].

Mimo tej różnorodności miejsca wiązania kalmoduliny dają się pogrupować w trzy motywy [5]. Motywy 1-8-14 i 1-5-10 wiążą kalmodulinę związaną z wapniem, a ich nazwy podają pozycje zachowanych reszt hydrofobowych w helisie, na przykład pierwszej, ósmej i czternastej [5]. Motyw IQ, nazwany od izoleucyny i glutaminy na jego początku, wiąże kalmodulinę niezależnie od wapnia [5]. Motywy te nie wyczerpują sposobów wiązania. W kompleksach z cyklazą adenylanową bakterii wąglika i z kanałem potasowym aktywowanym wapniem kalmodulina przyjmuje układy odmienne od klasycznego tunelu [31]. Z laktoferryną wiąże się w postaci wydłużonej, głównie płatem C [4]. Autorzy wnioskują z budowy tego kompleksu, że wolny płat N mógłby w tym czasie wiązać drugiego partnera [4]. Niezależność płatów poszerza więc repertuar kalmoduliny poza jeden sztywny sposób rozpoznawania celu.

Apokalmodulina ma własnych partnerów, a jej wiązanie przygotowuje białko do szybkiej odpowiedzi. Przegląd z 1999 roku wymieniał co najmniej 15 białek wiążących apokalmodulinę, w tym enzymy, białka cytoszkieletu, receptory i kanały jonowe [10]. Neuromodulina, białko działające po presynaptycznej stronie synapsy, i neurogranina, działająca po stronie postsynaptycznej, wiążą apokalmodulinę przez motyw IQ, a ich czynność zależy od wiązania i uwalniania kalmoduliny zależnie od wapnia [30]. W kanałach wapniowych typu L, czyli Cav1.2 i Cav1.3, kalmodulina jest przyczepiona do motywu IQ w cytoplazmatycznym ogonie kanału jeszcze przed napływem wapnia [32, 33]. Po otwarciu kanału wapń wiąże się z tą kalmoduliną, która wtedy wygasza kanał, czyli wywołuje inaktywację zależną od wapnia [32]. Podobnie kanały potasowe o małym przewodnictwie aktywowane wapniem (kanały SK) zawierają kalmodulinę jako stały składnik, a wapń związany z nią otwiera kanał [13]. Kalmodulina związana na stałe z białkiem prawdopodobnie przyspiesza jego odpowiedź na wapń, bo sygnał nie musi czekać na przyłączenie czujnika [10].

Białka docelowe kalmoduliny należą do kilku grup o różnym skutku wiązania. Kinaza łańcucha lekkiego miozyny (MLCK) fosforyluje łańcuch lekki miozyny i uruchamia skurcz mięśnia gładkiego [12]. Kinazy zależne od wapnia i kalmoduliny, w tym kinaza II (CaMKII), kinazy I i IV oraz aktywująca je kinaza kinaz (CaMKK), fosforylują białka synapsy i czynniki transkrypcyjne [9]. Kalmodulina pobudza też cyklazy adenylanowe typu 1 i 8 (AC1, AC8), które wytwarzają cAMP [34]. Pobudza również fosfodiesterazę typu 1 (PDE1), która rozkłada cAMP i cykliczny guanozynomonofosforan (cGMP) [35]. Wiążą ją wszystkie syntazy tlenku azotu (NOS) [14]. Wśród białek transportujących wapń jej celami są pompa wapniowa błony komórkowej (PMCA), która usuwa wapń z komórki [36], oraz receptor rianodynowy typu 2 (RyR2), kanał uwalniający wapń z siateczki sarkoplazmatycznej mięśnia sercowego [37].

Ten sam kompleks wapnia z kalmoduliną pobudza zatem zarówno syntezę, jak i rozkład cAMP, a także zarówno pompę usuwającą wapń, jak i inaktywację kanału, przez który wapń napływa. O skutku sygnału decyduje więc wyposażenie komórki w białka docelowe, a nie sama kalmodulina.

2.2. Regulacja dostępności

Kalmodulina działa przez wiązanie, a nie przez katalizę, dlatego siłę jej działania wyznacza ilość białka związanego z wapniem, które pozostaje wolne dla celów. Całkowite stężenie kalmoduliny w komórce jest wyraźnie niższe niż łączne stężenie białek, które mogą ją wiązać [38]. Kalmodulina jest więc czynnikiem ograniczającym, a jej cele konkurują o wspólną pulę [38]. Konkurencja ta sprzęga szlaki zależne od kalmoduliny, nawet gdy poza nią nie mają wspólnych białek [38].

Sprzężenie przez wspólną pulę wykazano bezpośrednio w hodowli bydlęcych komórek śródbłonka. Zmiana stanu ufosforylowania śródbłonkowej syntazy tlenku azotu zwiększała około trzykrotnie zarówno ilość związanej z nią kalmoduliny, jak i jej aktywność [36]. Syntaza mogła wiązać do 25% całej kalmoduliny komórki [36]. Jednocześnie stężenie wolnego kompleksu wapnia z kalmoduliną spadało, a aktywność pompy PMCA malała o 40% [36]. W mięśniu gładkim pęcherza moczowego myszy aktywacja MLCK po depolaryzacji narastała szybko, ale nie osiągała maksimum, co autorzy wiązali z ograniczoną ilością kalmoduliny w komórce [12]. Wzrost aktywności jednego celu odbiera więc kalmodulinę innym, nawet przy niezmienionym stężeniu wapnia.

Drugim poziomem regulacji jest fosforylacja samej kalmoduliny. Kalmodulinę fosforylują in vitro i w komórkach kinazy serynowo-treoninowe, takie jak kinaza kazeinowa II i MLCK, oraz kinazy tyrozynowe, w tym receptor insuliny, receptor naskórkowego czynnika wzrostu i kinazy z rodziny Src [39]. Ufosforylowane postacie kalmoduliny działają na układy od niej zależne inaczej niż postać niefosforylowana [39]. Fosforylacja dołącza w ten sposób do sygnału wapniowego informację z receptorów czynników wzrostu i hormonów. Kalmodulina nie jest więc biernym przekaźnikiem jednego jonu, lecz miejscem, w którym stężenie wapnia, konkurencja celów i stan fosforylacji łącznie ustalają odpowiedź komórki.

2.3. Miejsce w szlaku

W sygnalizacji wapniowej kalmodulina zajmuje miejsce odbiornika, położone między wzrostem stężenia wapnia a białkami, które zmieniają czynność komórki. Od niej sygnał rozchodzi się w kilku kierunkach naraz. Pierwszym jest fosforylacja białek przez kinazy CaMK i usuwanie reszt fosforanowych przez kalcyneurynę [8, 9]. Drugim są cykliczne nukleotydy: kalmodulina pobudza zarówno cyklazy AC1 i AC8, jak i fosfodiesterazę PDE1, więc łączy sygnał wapniowy z sygnałem cAMP [34, 35]. Trzecim jest tlenek azotu, którego wszystkie syntazy wymagają kalmoduliny [14]. Czwarty kierunek prowadzi z powrotem do samego wapnia. Kalmodulina wygasza kanały wapniowe typu L przez inaktywację zależną od wapnia, co tworzy ujemne sprzężenie zwrotne [32]. Hamuje też receptor RyR2 i pobudza pompę PMCA, które odpowiednio ograniczają uwalnianie wapnia i przyspieszają jego usuwanie [36, 37]. Kalmodulina nie tylko odczytuje sygnał wapniowy, lecz także go kształtuje.

2.4. Zmienność genetyczna

Zmienność genów kalmoduliny w populacji jest znacznie mniejsza, niż wynikałoby z przypadku [19]. Warianty opisane u chorych z zaburzeniami rytmu serca to zmiany pojedynczych aminokwasów [37, 41, 42]. Pierwszy taki wariant opisali Nyegaard i współpracownicy w 2012 roku w dużej szwedzkiej rodzinie z ciężkimi, dziedziczonymi dominująco komorowymi zaburzeniami rytmu serca [41]. Analiza sprzężeń wskazała chromosom 14, a w genie CALM1 znaleziono zmianę asparaginy na izoleucynę w pozycji 53 [41]. Drugą zmianę, powstałą de novo, wykryto w badaniu przesiewowym 61 osób z zaburzeniami rytmu bez mutacji w genie RYR2 [41]. Oba warianty osłabiały wiązanie wapnia [41]. W 2013 roku Crotti i współpracownicy znaleźli metodą sekwencjonowania eksomu trzy warianty de novo w genach CALM1 i CALM2 u niemowląt z nawracającym zatrzymaniem krążenia i znacznie wydłużonym odstępem QT [42]. Warianty leżały w pętlach wiążących wapń płata C lub w ich sąsiedztwie i kilkakrotnie obniżały powinowactwo kalmoduliny do wapnia [42].

Choroby wywołane wariantami kalmoduliny nazywa się kalmodulinopatiami. Międzynarodowy rejestr kalmodulinopatii zebrał do 2019 roku dane 74 nosicieli wariantów: 36 w genie CALM1, 23 w CALM2 i 15 w CALM3 [20]. Dwa główne fenotypy to zespół wydłużonego odstępu QT (ang. long QT syndrome, LQTS), w którym opóźnione jest wygaszanie pobudzenia komór, oraz katecholaminergiczny wielokształtny częstoskurcz komorowy (ang. catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia, CPVT), wyzwalany wysiłkiem lub emocjami [20, 41]. Warianty związane z tymi dwoma fenotypami różnią się wpływem na wiązanie wapnia [37].

Ten sam typ zmiany, czyli podstawienie jednego aminokwasu w identycznym białku, daje więc różne choroby, zależnie od tego, które pole kontaktu z celami zostaje zaburzone. Wynika to z wielości partnerów kalmoduliny, bo wariant może zmieniać wiązanie jednego celu i oszczędzać inne [37].

3. Znaczenie kliniczne

3.1. Następstwa zmiany aktywności

Następstwa zmiany kalmoduliny najlepiej poznano w komórkach mięśnia sercowego, w których dwa jej cele, kanał Cav1.2 i receptor RyR2, decydują o przebiegu pobudzenia [11]. Nosiciel wariantu ma zwykle jeden wadliwy allel obok prawidłowych, więc zmieniona kalmodulina stanowi tylko część puli białka. Mimo to w badaniach eksperymentalnych niewielka domieszka wadliwej kalmoduliny wystarczała do zaburzenia czynności obu kanałów [37, 43].

Warianty związane z LQTS uderzają w inaktywację kanału wapniowego. W prawidłowej komórce wapń napływający przez kanał Cav1.2 wiąże się z przyczepioną do niego kalmoduliną, która zamyka kanał i skraca napływ wapnia. Po wprowadzeniu wariantów LQTS do komórek HEK293 i do kardiomiocytów komór świnki morskiej inaktywacja zależna od wapnia była silnie osłabiona [43]. Kanał dłużej przewodził prąd wapniowy, potencjał czynnościowy się wydłużał, a przejściowe wzrosty stężenia wapnia były większe [43]. Autorzy wykazali, że tak mała frakcja zmienionej kalmoduliny, jak u heterozygotycznych chorych, wystarcza do istotnego osłabienia inaktywacji [43]. Wydłużony potencjał czynnościowy komórek komór odpowiada wydłużonemu odstępowi QT w zapisie elektrokardiograficznym.

Warianty związane z CPVT działają głównie na receptor RyR2, który prawidłowa kalmodulina hamuje [37]. W permeabilizowanych kardiomiocytach komór myszy, czyli komórkach o błonie przepuszczalnej dla białek z roztworu, kalmodulina z wariantem CPVT, podana w stężeniu fizjologicznym 100 nmol/l, wywoływała więcej samoistnych fal i iskier wapniowych niż kalmodulina prawidłowa [37]. Warianty te silniej wiązały się z RyR2 i zwiększały prawdopodobieństwo otwarcia pojedynczego kanału [37]. Fale wapniowe pojawiały się nawet przy mieszaninie jednej części kalmoduliny zmienionej na osiem części prawidłowej, co tłumaczy dominujące dziedziczenie choroby [37]. Warianty LQTS nie wywoływały fal wapniowych, a żaden z badanych wariantów nie zmieniał wiązania z kinazą CaMKII [37]. Dwa fenotypy kalmodulinopatii wynikają więc z zaburzenia dwóch różnych celów: nadmiernego napływu wapnia przez niewygaszony kanał Cav1.2 albo nadmiernego uwalniania wapnia z siateczki przez RyR2 [11].

3.2. Udział kalmoduliny w chorobach

Kalmodulinopatie to rzadkie, zagrażające życiu zespoły zaburzeń rytmu serca, które dotyczą głównie dzieci i młodych osób [20]. W rejestrze z 2019 roku objawy miało 86,5% nosicieli, a skumulowana śmiertelność dziesięcioletnia wynosiła 27% [20]. Najcięższą postacią okazał się LQTS związany z kalmoduliną. Skorygowany odstęp QT wynosił u tych chorych średnio 594 ms, groźne zaburzenia rytmu wystąpiły u 78% z nich, a mediana wieku ich wystąpienia wynosiła 1,5 roku [20]. Odpowiedź tej grupy na dostępne leczenie autorzy ocenili jako słabą [20]. Wszyscy chorzy z CPVT związanym z kalmoduliną mieli objawy, z medianą wieku ich pojawienia się 6 lat [20]. U części nosicieli pierwszym przejawem choroby było idiopatyczne migotanie komór albo nagły niewyjaśniony zgon [20].

Obraz kalmodulinopatii nie ogranicza się do zaburzeń rytmu. Już pierwsze opisy niemowląt z wariantami CALM1 i CALM2 wymieniały u części z nich padaczkę i opóźnienie rozwoju psychoruchowego [42]. W rejestrze z 2023 roku, obejmującym 140 osób, pierwotne objawy neurologiczne, niezwiązane z niedotlenieniem po zatrzymaniu krążenia, wystąpiły u 20 z nich [44]. Prace rejestrowe opisują te objawy klinicznie, a ich powiązanie z konkretnymi celami kalmoduliny w neuronach pozostaje hipotezą. Wady strukturalne serca, czyli kardiomiopatie albo wrodzone wady serca, stwierdzono u 30% nosicieli, głównie w grupie LQTS, i opisano zgony z powodu niewydolności serca [44].

Wraz z rozwojem rejestru obraz kliniczny okazał się łagodniejszy i bardziej zróżnicowany niż w pierwszych opisach. W kohorcie z 2023 roku zdarzenia sercowe wystąpiły u 61% osób wobec 85% w kohorcie z 2019 roku, a nagły zgon u 9% wobec 27% [44]. Rejestr obejmował już 43 członków rodzin, a przybywało rodzin, w których ten sam wariant dawał u krewnych wyraźnie różne fenotypy [44]. Spektrum choroby sięga więc od groźnych zaburzeń rytmu we wczesnym dzieciństwie do braku objawów, a udział postaci łagodnych i rodzinnych rośnie [44]. Ciężkość kalmodulinopatii zależy zatem nie tylko od samego wariantu, lecz także od czynników, które różnicują przebieg choroby u krewnych.

3.3. Punkt uchwytu leków

Kalmodulina jest punktem uchwytu związków używanych głównie w badaniach, a leki kliniczne działają zwykle na jej cele. Trifluoperazyna, lek przeciwpsychotyczny z grupy fenotiazyn, wiąże kalmodulinę w obecności wapnia i w ten sposób hamuje pobudzanie fosfodiesterazy [45]. Wiązanie to było wybiórcze: spośród innych białek wiążących wapń trifluoperazyna wiązała się istotnie tylko z troponiną C, i to w odmienny, kooperatywny sposób [45]. Autorzy uznali, że wiązanie z kalmoduliną może tłumaczyć część biochemicznych i farmakologicznych działań tego leku [45]. Związek W-7 wiąże kalmodulinę, hamuje enzymy od niej zależne i przenika przez błonę komórkową, dlatego służy jako narzędzie do wykazania udziału kalmoduliny w procesach komórkowych [40].

Najważniejsze klinicznie leki związane z kalmoduliną działają na jej cel, kalcyneurynę. Cyklosporyna A i takrolimus tworzą w komórce kompleksy z białkami wiążącymi, odpowiednio cyklofiliną i białkiem FKBP [46]. Oba kompleksy wiążą i hamują kalcyneurynę, a ich działanie nie wymaga obecności kalmoduliny [46]. Leki te nie blokują więc samego czujnika wapnia, lecz jedną z gałęzi sygnału, co jest podstawą ich działania immunosupresyjnego [8, 46].

W kalmodulinopatiach leczenie jest skierowane na wyzwalacz zaburzeń rytmu, a nie na zmienione białko. Zaburzenia rytmu w tych zespołach są w dużej mierze wyzwalane pobudzeniem adrenergicznym [20]. Stosuje się więc farmakologiczne i chirurgiczne metody antyadrenergiczne, często razem z lekami blokującymi kanały sodowe i wszczepialnym kardiowerterem-defibrylatorem [44]. Leczenie skojarzone lekami, odnerwieniem współczulnym serca i urządzeniami wszczepialnymi autorzy rejestru z 2019 roku uznali za wymagające rozważenia, bo skuteczność pojedynczych metod była niewystarczająca, zwłaszcza w LQTS [20]. Według autorów rejestru z 2023 roku brak twardych danych, które pozwalałyby sformułować jednoznaczne zalecenia terapeutyczne [44].

3.4. Czynniki wpływające na aktywność kalmoduliny

Aktywność kalmoduliny zależy przede wszystkim od jonów, które konkurują o jej ręce EF. Głównym czynnikiem jest samo stężenie wapnia w cytoplazmie. Przy umiarkowanym wzroście stężenia jony obsadzają głównie płat C, a pełne obsadzenie obu płatów wymaga silniejszego sygnału, bo płat N ma około sześciokrotnie niższe powinowactwo [16]. Kalmodulina odróżnia więc słaby sygnał wapniowy od silnego stopniem obsadzenia płatów.

Drugim czynnikiem jest magnez, którego stężenie w komórce jest około tysiąckrotnie wyższe niż stężenie wapnia [47]. Wolny magnez w cytoplazmie utrzymuje się w wąskim zakresie 0,5–1,0 mmol/l i w stanie spoczynku może częściowo lub całkowicie wysycać miejsca wiązania wapnia w wielu białkach z rękami EF [2]. W płacie N kalmoduliny magnez zajmuje miejsce wapnia, ale nie wiąże reszty glutaminianu w dwunastej pozycji pętli [47]. To właśnie dwukleszczowe wiązanie tej reszty z wapniem jest niezbędne do otwarcia płata [47]. Magnez stabilizuje więc zamkniętą konformację, podobną do postaci apo [47]. Przy fizjologicznym stężeniu magnezu powinowactwo płata N do wapnia jest wyraźnie niższe, a przy stężeniach wapnia typowych dla pobudzonej komórki płat ten rzadko wiąże dwa jony, jeśli nie towarzyszy temu przyłączenie białka docelowego [48]. Magnez sprzyja więc wyłączeniu kalmoduliny, a przez nią jej celów, przy spoczynkowym stężeniu wapnia [2, 47].

Z tej roli magnezu Grabarek wyprowadził hipotezę, że część stanów przypisywanych niedoborowi magnezu może wynikać z nadmiernego pobudzenia procesów regulowanych wapniem [2]. Hipoteza opiera się na danych strukturalnych i biochemicznych, a w cytowanych pracach nie badano, czy podaż magnezu zmienia czynność kalmoduliny u człowieka. Czynnikiem niemodyfikowalnym jest genotyp. Warianty genów CALM1, CALM2 i CALM3 zmieniają powinowactwo kalmoduliny do wapnia albo jej wiązanie z określonymi celami [37, 42]. Aktywność kalmoduliny wyznaczają zatem głównie właściwości wewnątrzkomórkowego środowiska jonowego i budowa samego białka.

4. Na co warto zwrócić uwagę

W praktyce klinicznej informację o kalmodulinie daje badanie genetyczne genów CALM1, CALM2 i CALM3 [41, 44]. Już autorzy pierwszego opisu wariantów uznali geny CALM za kandydatów do badań u osób i rodzin z idiopatycznym częstoskurczem komorowym oraz niewyjaśnionym nagłym zgonem sercowym [41]. Wynik takiego badania może wskazać przyczynę zaburzeń rytmu i umożliwia badanie krewnych, dzięki którym rejestr objął już członków rodzin nosicieli [44]. Obecność wariantu nie przesądza jednak o przebiegu choroby, bo w tych samych rodzinach opisano nosicieli o wyraźnie różnych fenotypach, także bezobjawowych [44].

Kalmodulina bywa opisywana jako białko magazynujące wapń, co myli czujnik z buforem. Rola bufora wapniowego należy do innych białek, takich jak parwalbuminy i kalbindyny [6]. Kalmodulina wiąże wapń po to, aby zmienić kształt i przekazać sygnał białkom docelowym [5, 15]. Mylące jest też założenie, że więcej wapnia oznacza proporcjonalnie więcej aktywnej kalmoduliny. Odpowiedź ogranicza konkurencja celów o wspólną pulę białka oraz magnez, który stabilizuje postać nieaktywną [38, 47].

Siła dowodów różni się między poziomami opisu. Budowa kalmoduliny i sposób wiązania celów wynikają z badań krystalograficznych i spektroskopowych, a więc z danych o dużej pewności dla izolowanego białka [15, 17]. Mechanizmy kalmodulinopatii ustalono natomiast w komórkach hodowlanych oraz w kardiomiocytach myszy i świnki morskiej [37, 43]. Dane kliniczne pochodzą z rejestru obserwacyjnego, który w 2023 roku obejmował 140 osób [44]. Wnioski o rokowaniu i leczeniu opierają się więc na małej grupie, w której przeważają probanci, czyli osoby rozpoznane w rodzinie jako pierwsze (97 ze 140) [44]. Działania antagonistów kalmoduliny w komórce też wymagają ostrożnej interpretacji, bo trifluoperazyna wiąże również troponinę C, a W-7 hamuje wiele enzymów zależnych od kalmoduliny naraz [40, 45].