cAMP i cGMP

1. Profil substancji

1.1. Definicja i klasyfikacja

Cykliczny adenozynomonofosforan (ang. cyclic adenosine monophosphate, cAMP) i cykliczny guanozynomonofosforan (ang. cyclic guanosine monophosphate, cGMP) to nukleotydy cykliczne należące do przekaźników wtórnych. Przekaźnik wtórny przenosi sygnał od receptora w błonie komórkowej do białek wewnątrz komórki. Pełne nazwy chemiczne obu cząsteczek brzmią: cykliczny 3′,5′-adenozynomonofosforan i cykliczny 3′,5′-guanozynomonofosforan. Cyklaza adenylanowa wytwarza cAMP z adenozynotrifosforanu (ATP), a cyklaza guanylanowa wytwarza cGMP z guanozynotrifosforanu (GTP) [1, 2]. Fosfodiesterazy nukleotydów cyklicznych rozkładają oba przekaźniki i w ten sposób kończą sygnał [3].

W klasyfikacji cząsteczek sygnałowych cAMP i cGMP zajmują miejsce między receptorem a efektorem. Nie działają poza komórką, która je wytworzyła, tak jak hormon, lecz przekazują w jej wnętrzu informację, że receptor został pobudzony. Cykliczny AMP był pierwszym opisanym przekaźnikiem wtórnym, a jego odkrycie w 1957 roku dotyczyło działania adrenaliny [4]. Cykliczny GMP wyizolowano kilka lat później, a w piśmiennictwie długo występował jako cząsteczka towarzysząca cAMP [4, 5].

Nukleotydy cykliczne łatwo pomylić z pokrewnymi cząsteczkami, dlatego kryterium odróżniającym jest wiązanie fosforanu. W cAMP i cGMP jedna reszta fosforanowa łączy jednocześnie trzeci i piąty atom węgla rybozy, tworząc pierścień. Adenozynomonofosforan (AMP) i guanozynomonofosforan (GMP) mają fosforan przyłączony tylko do piątego atomu węgla i powstają właśnie z rozkładu nukleotydów cyklicznych [3]. ATP jest dla cAMP substratem i nośnikiem energii, a nie przekaźnikiem tego samego sygnału. Myląca bywa też nazwa cyklicznego GMP-AMP (cGAMP). Cząsteczkę tę wytwarza syntaza cGAS po wykryciu obcego DNA w cytoplazmie, a cGAMP aktywuje białko STING i uruchamia wytwarzanie interferonów pierwszego typu [6]. Różni się więc od cAMP i cGMP budową, bo łączy dwa nukleotydy, oraz funkcją, bo służy odporności, a nie przekazywaniu sygnałów hormonów.

Od innych przekaźników wtórnych cAMP i cGMP różnią się pochodzeniem. Jony wapnia nie są syntetyzowane, lecz uwalniane z magazynów komórki albo napływają z zewnątrz. Diacyloglicerol i trifosforan inozytolu powstają z rozkładu lipidów błony. Nukleotydy cykliczne są natomiast produktem osobnych enzymów, cyklaz, które komórka włącza i wyłącza w odpowiedzi na bodźce. Sygnalizacja nukleotydami cyklicznymi obejmuje cyklazy, które je wytwarzają, białka, które je odczytują, oraz fosfodiesterazy, które je rozkładają. Obie cząsteczki dzielą budowę, zasadę syntezy i rozkładu oraz część białek docelowych, dlatego opisuje się je łącznie. Cykl aktywacji białek poprzedzających cyklazę należy do fizjologii białek G, a powstawanie gazowego przekaźnika do fizjologii tlenku azotu. Znaczenie obu nukleotydów wynika z zasięgu: przez nie działa wiele hormonów i neuroprzekaźników, a badania nad nimi przyniosły pięć Nagród Nobla [4, 7].

1.2. Budowa i różnice między postaciami

Obie cząsteczki zbudowane są z zasady azotowej, rybozy i jednej reszty fosforanowej zamkniętej w pierścień. Różnią się tylko zasadą: cAMP zawiera adeninę, a cGMP guaninę. Ta niewielka różnica wystarcza, by białka wiążące rozpoznawały jeden nukleotyd znacznie lepiej niż drugi. Dzięki temu komórka może prowadzić dwa odrębne sygnały zbudowane według tego samego planu.

Pierwszą różnicą jest źródło. Cyklazy adenylanowe występują głównie w błonie komórkowej i są włączane przez białko G pobudzające, oznaczane Gs [1]. Cyklazy guanylanowe mają dwie postaci: rozpuszczalną w cytoplazmie, pobudzaną przez tlenek azotu, oraz błonową, która sama jest receptorem hormonów peptydowych [2, 8]. Drugą różnicą są odbiorniki. Cykliczny AMP działa głównie przez kinazę białkową A (PKA) i białko Epac, a cGMP głównie przez kinazę białkową G (PKG) [9–11]. Trzecią różnicą jest rozkład. Fosfodiesterazy (PDE) dzielą się na rodziny oznaczane numerami, a część z nich rozkłada wybiórczo cAMP, część wybiórczo cGMP, a część oba nukleotydy [3, 12].

Obie cząsteczki niosą ładunek ujemny, więc nie przechodzą swobodnie przez błonę komórkową. Komórka usuwa je na zewnątrz za pomocą białek transportujących zależnych od energii [13]. Różnią się też stężeniem. W komórkach przysadki szczura stężenie cGMP nie przekraczało 1–2 µmol/l, a cAMP gromadził się w zakresie od 1 do 100 µmol/l [13]. Te same różnice zestawia tabela.

Zestawienie pokazuje, że oba nukleotydy dzielą zasadę działania, ale mają osobne źródła, odbiorniki i drogi rozkładu. Z tego wynika praktyczna konsekwencja: lek działający na jedną rodzinę fosfodiesteraz zmienia zwykle głównie jeden z dwóch sygnałów.

1.3. Rys historyczny

Do połowy ubiegłego stulecia nie wyjaśniono, jak hormon działający na powierzchni komórki zmienia aktywność enzymów w jej wnętrzu. Odpowiedź przyniosły badania Earla Sutherlanda nad działaniem adrenaliny [4]. W 1957 roku ustalono, że cAMP pośredniczy w działaniu adrenaliny [4]. W 1958 roku Rall i Sutherland opisali cykliczny rybonukleotyd adeninowy powstający we frakcji cząstek tkankowych i scharakteryzowali jego budowę [14, 15]. Z tych prac wyrosło pojęcie przekaźnika wtórnego, czyli cząsteczki przenoszącej sygnał pierwszego przekaźnika, hormonu, do wnętrza komórki [4, 16]. Za to odkrycie Sutherland otrzymał w 1971 roku Nagrodę Nobla [17].

W 1963 roku Ashman i współpracownicy wyizolowali z moczu szczura drugi nukleotyd cykliczny, cGMP [5]. Bodziec włączający jego syntezę wskazała dopiero praca zespołu Murada z 1977 roku. Tlenek azotu zwiększał w niej aktywność cyklazy guanylanowej w wyciągach z tkanek zwierzęcych, najsilniej w wątrobie, płucach, sercu, nerkach i mózgu, od 19 do 33 razy [18]. Ten sam gaz podnosił w tkankach stężenie cGMP, ale nie cAMP [18]. Badania nad nukleotydami cyklicznymi pozwoliły zrozumieć przekazywanie sygnałów przez błonę i sprzężenie receptorów z efektorami [4].

1.4. Synteza i źródła

Oba nukleotydy powstają wewnątrz komórki, która ich używa, a tempo syntezy zależy od aktywności cyklaz. Cyklaza adenylanowa odcina od ATP dwie reszty fosforanowe i zamyka pozostały fosforan w pierścień. Cyklaza guanylanowa przeprowadza tę samą reakcję na GTP. Każda z tych rodzin enzymów ma kilka postaci różniących się bodźcem i miejscem występowania.

Komórki ssaków mają dziewięć błonowych izoform cyklazy adenylanowej, oznaczanych od AC1 do AC9, oraz jedną rozpuszczalną, sAC, nazywaną też AC10 [1]. Izoformy błonowe włącza białko Gs, czyli białko G pobudzające, uwolnione z receptora po związaniu hormonu [1]. Część izoform, zwłaszcza AC1, AC5 i AC6, hamuje natomiast białko Gi, czyli białko G hamujące, sprzężone z innymi receptorami [1]. Ten układ pozwala jednej komórce sumować sygnały pobudzające i hamujące w jednym enzymie. Rozpuszczalna cyklaza sAC nie reaguje na białka G. Wodorowęglany pobudzają ją bezpośrednio i niezależnie od pH, co zbadano najpierw w plemnikach [19]. Cyklazy błonowe, z wyjątkiem mało wrażliwej AC9, aktywuje też forskolina, diterpen roślinny, który wiąże się z enzymem w miejscu bez znanego ligandu naturalnego [1].

Cykliczny GMP powstaje w dwóch odrębnych układach. Rozpuszczalna cyklaza guanylanowa jest receptorem tlenku azotu, ale reaguje na niego tylko wtedy, gdy zawiera hem z żelazem dwuwartościowym [8]. Genom ssaków koduje też siedem cyklaz błonowych, od GC-A do GC-G [2]. Każda z nich ma część zewnątrzkomórkową wiążącą ligand, krótki odcinek przechodzący przez błonę i wewnątrzkomórkową część katalityczną [2].

Tabela pokazuje, że różne bodźce zbiegają się na dwóch cząsteczkach. Dlatego te same nukleotydy przenoszą sygnały hormonów, gazu i peptydów, a o znaczeniu sygnału decyduje enzym i tkanka [1, 2].

2. Mechanizm działania i funkcje

2.1. Efektory i punkty uchwytu

Cykliczne nukleotydy nie mają receptorów w błonie komórkowej, ponieważ działają wyłącznie wewnątrz komórki. Ich punktami uchwytu są białka cytoplazmatyczne i kanały jonowe, które zawierają domenę wiążącą nukleotyd cykliczny. Związanie cAMP lub cGMP zmienia kształt takiego białka i włącza jego czynność. Białko docelowe decyduje więc o tym, jaki skutek wywoła wzrost stężenia przekaźnika.

Najlepiej poznanym odbiornikiem cAMP jest kinaza białkowa A. W stanie spoczynku występuje jako holoenzym złożony z dwóch podjednostek katalitycznych i dwóch regulatorowych [9]. Każda podjednostka regulatorowa ma dwie domeny wiążące cAMP i blokuje podjednostkę katalityczną [20]. Związanie cAMP zmienia kształt podjednostek regulatorowych, a te uwalniają podjednostki katalityczne. Aktywacja przebiega kooperatywnie, więc niewielki wzrost stężenia cAMP włącza kinazę gwałtownie [20]. Wolne podjednostki katalityczne przenoszą fosforan z ATP na serynę lub treoninę białek docelowych i zmieniają ich aktywność. Aktywność PKA zależy przy tym tylko od cAMP, a nie od fosforylacji pętli aktywacyjnej, jak w wielu innych kinazach [9].

W 1998 roku opisano drugi odbiornik cAMP, niezależny od PKA. Białko Epac, czyli białko wymiany aktywowane bezpośrednio przez cAMP, włącza małe białko Rap1, które wiąże guanozynotrifosforan [10]. Białko Rap1 uczestniczy w proliferacji i różnicowaniu komórek oraz w aktywacji płytek krwi, a odkrycie Epac poszerzyło zakres sygnałów, które cAMP przekazuje z pominięciem PKA [10, 21]. Trzecim odbiornikiem są kanały jonowe. Kanały HCN, czyli kanały kationowe aktywowane hiperpolaryzacją i regulowane nukleotydami cyklicznymi, otwiera przede wszystkim zmiana napięcia błony [22]. U ssaków rodzina ta obejmuje cztery kanały, od HCN1 do HCN4, obecne w sercu i w układzie nerwowym [23]. Cykliczny AMP wiąże się z nimi bezpośrednio i przesuwa próg ich otwarcia w stronę wyższego napięcia, bez udziału fosforylacji [24]. Kanały CNG, czyli kanały bramkowane nukleotydami cyklicznymi, otwiera natomiast samo związanie cAMP lub cGMP [25].

Cykliczny GMP ma trzy główne grupy odbiorników: kinazy białkowe G, kanały CNG i fosfodiesterazy regulowane przez ten nukleotyd [11]. Kinaza PKG, podobnie jak PKA, fosforyluje serynę i treoninę, ale działa na inne białka, zwłaszcza te regulujące stężenie wapnia i skurcz mięśni gładkich [11]. Przez fosfodiesterazy cGMP zmienia rozkład cAMP, o czym decyduje rodzina enzymu [26]. Kolejnym odbiornikiem cAMP są białka POPDC, zawierające domenę Popeye. Domena ta wiązała cAMP z dużym powinowactwem, a białka POPDC łączyły się z kanałem potasowym TREK-1 i zwiększały płynący przez niego prąd, co cAMP osłabiał [27]. Rolę tych białek u ludzi dopiero się bada.

Zestawienie pokazuje, że ten sam przekaźnik trafia do białek o zupełnie różnej naturze. Skutek wzrostu cAMP w danej komórce zależy zatem od tego, które z tych odbiorników komórka wytwarza i gdzie je umieszcza.

2.2. Kaskada sygnałowa

Kaskada nukleotydów cyklicznych zamienia jedno zdarzenie w błonie na zmianę aktywności wielu białek. Na etapach enzymatycznych sygnał ulega wzmocnieniu, bo jeden aktywny enzym przetwarza wiele cząsteczek substratu. Trzy kaskady dobrze ilustrują tę zasadę: odpowiedź serca na adrenalinę, rozkurcz naczynia pod wpływem tlenku azotu i widzenie w fotoreceptorze.

W sercu stanem wyjściowym jest niskie stężenie cAMP w komórce mięśniowej. Bodźcem jest adrenalina albo noradrenalina, która wiąże się z receptorem β1-adrenergicznym, jednym z receptorów metabotropowych [28]. Receptor aktywuje białko Gs, a ono włącza błonową cyklazę adenylanową [1]. Stężenie cAMP rośnie, cAMP wiąże się z podjednostkami regulatorowymi PKA i uwalnia podjednostki katalityczne [9]. Kinaza fosforyluje białka odpowiedzialne za obieg wapnia w komórce mięśniowej. Stanem końcowym jest szybsza praca serca i silniejszy skurcz [28]. Konsekwencją jest dostosowanie pojemności minutowej serca do wysiłku albo stresu.

W naczyniu krwionośnym kaskada biegnie od gazu, a nie od hormonu. Tlenek azotu dyfunduje ze śródbłonka do komórki mięśnia gładkiego i wiąże się z hemem rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej [8]. Enzym wytwarza cGMP, a ten aktywuje kinazę PKG [11]. PKG fosforyluje białka regulujące stężenie wapnia i wrażliwość aparatu kurczliwego na wapń [11]. Mięsień gładki się rozkurcza, a światło naczynia rośnie. Konsekwencją jest wzrost przepływu krwi w narządzie i spadek oporu naczyniowego.

W fotoreceptorze siatkówki oka kierunek jest odwrotny, bo sygnałem jest spadek stężenia nukleotydu. W ciemności stężenie cGMP jest wysokie, kanały CNG pozostają otwarte, a kationy wpływają do komórki [25]. Foton zmienia kształt rodopsyny, a ta aktywuje białko G fotoreceptorów, transducynę [29]. Transducyna włącza fosfodiesterazę cGMP, czyli PDE6, która szybko rozkłada cGMP [29]. Spadek stężenia cGMP zamyka kanały CNG, więc błona fotoreceptora ulega hiperpolaryzacji [30]. Fotoreceptor ogranicza wtedy uwalnianie neuroprzekaźnika, co dla siatkówki oznacza sygnał światła. Po zakończeniu bodźca cyklazy GC-E i GC-F, pobudzane przez białka wrażliwe na wapń, odtwarzają zapas cGMP [2].

adrenalina → receptor β1 → Gs → cyklaza adenylanowa → cAMP ↑ → PKA → skurcz silniejszy i szybszy tlenek azotu → rozpuszczalna cyklaza guanylanowa → cGMP ↑ → PKG → rozkurcz mięśnia gładkiego światło → rodopsyna → transducyna → PDE6 → cGMP ↓ → zamknięcie kanałów CNG → hiperpolaryzacja

Schemat zestawia te same trzy ciągi zdarzeń w skróconej postaci. Wspólną cechą wszystkich trzech jest to, że o skutku decyduje nie sam nukleotyd, lecz enzym, który go wytwarza lub rozkłada, oraz białko, które go odczytuje [11, 29].

2.3. Funkcje

2.3.1. Przekaźnik hormonów metabolicznych

Cykliczny AMP przenosi do wnętrza komórki sygnały hormonów, które mobilizują zapasy energii. Pierwszym opisanym przykładem była adrenalina, której działanie na komórkę wymagało wytworzenia cAMP [4]. W tkance tłuszczowej ten sam przekaźnik steruje lipolizą, czyli rozkładem trójglicerydów do kwasów tłuszczowych i glicerolu [31]. Pobudzenie receptorów β-adrenergicznych podnosi stężenie cAMP w adipocycie. Kinaza PKA fosforyluje wtedy lipazę wrażliwą na hormony i perilipinę, białko pokrywające kroplę tłuszczu [31]. Perilipina po fosforylacji odsłania trójglicerydy, a lipaza przemieszcza się na powierzchnię kropli i je rozkłada.

Insulina działa w przeciwnym kierunku, ponieważ obniża stężenie cAMP w adipocycie i hamuje lipolizę [31]. Oba hormony regulują więc ten sam proces przez zmianę stężenia jednego nukleotydu. Do mediatorów lipolizy należą również przedsionkowy peptyd natriuretyczny i cGMP [31]. Ta droga omija cAMP i pozwala sercu, które wydziela peptyd, wpływać na uwalnianie kwasów tłuszczowych. Dzięki dwóm nukleotydom tkanka tłuszczowa odpowiada zarówno na sygnały układu współczulnego, jak i na sygnały krążenia.

2.3.2. Rytm i siła skurczu serca

Cykliczny AMP jest głównym przekaźnikiem, przez który układ współczulny przyspiesza i wzmacnia pracę serca. Receptor β1 odpowiada za większość dodatnich efektów chronotropowych i inotropowych katecholamin, czyli za przyspieszenie rytmu i wzrost siły skurczu [28]. Obie odpowiedzi biegną przez cyklazę adenylanową i cAMP. Siłę skurczu zwiększa głównie PKA, która fosforyluje białka obiegu wapnia. Tempo rytmu zależy w dużym stopniu od prądu rozrusznikowego If w komórkach węzła zatokowego [24].

Prąd If płynie przez kanały HCN i odpowiada za powolną depolaryzację komórek rozrusznikowych między kolejnymi skurczami [23]. Adrenalina i acetylocholina regulują ten prąd w przeciwnych kierunkach, a obie działają przez cAMP [24]. Adrenalina podnosi stężenie cAMP, więc kanały HCN otwierają się łatwiej, a rytm przyspiesza. Acetylocholina z nerwu błędnego obniża stężenie cAMP i rytm zwalnia. U myszy pozbawionych białek POPDC stres fizyczny lub psychiczny wywoływał ciężką dysfunkcję węzła zatokowego, a z wiekiem rozwijała się bradyarytmia [27]. Dane te wskazują, że prawidłowa odpowiedź rozrusznika na stres wymaga kilku odbiorników cAMP jednocześnie, choć u ludzi rolę POPDC dopiero się bada.

2.3.3. Napięcie mięśni gładkich i płytki krwi

Cykliczny GMP przenosi sygnał rozkurczu mięśni gładkich naczyń, a działanie tlenku azotu biegnie przede wszystkim przez ten nukleotyd [11]. Przez PKG reguluje skurcz mięśni gładkich, aktywację i przyleganie płytek krwi oraz czynność serca [11]. Sygnał dociera do mięśnia z dwóch stron. Tlenek azotu uwalniany ze śródbłonka pobudza rozpuszczalną cyklazę guanylanową, a przedsionkowy i mózgowy peptyd natriuretyczny pobudzają cyklazę błonową GC-A [2]. Droga peptydowa reguluje ciśnienie tętnicze i objętość krwi krążącej [2].

W płytkach krwi cGMP hamuje aktywację i przyleganie, więc przeciwdziała tworzeniu zakrzepu [11]. W mięśniówce gładkiej ciał jamistych prącia ten sam mechanizm prowadzi do napływu krwi i wzwodu. Dlatego leki hamujące rozkład cGMP stosuje się w zaburzeniach erekcji i w nadciśnieniu płucnym, a azotany dostarczające tlenku azotu w dławicy piersiowej [11]. W każdym z tych narządów o sile rozkurczu decyduje równowaga między tempem syntezy cGMP a tempem jego rozkładu przez fosfodiesterazy. Konsekwencją tej budowy szlaku jest możliwość wpływania na przepływ krwi z dwóch stron: przez zwiększenie syntezy albo przez spowolnienie rozkładu.

2.3.4. Transdukcja zmysłowa

W narządach wzroku i węchu nukleotydy cykliczne zamieniają bodziec fizyczny lub chemiczny na zmianę potencjału błony. Kanały CNG opisano najpierw właśnie w fotoreceptorach siatkówki i w neuronach czuciowych węchowych [25]. W fotoreceptorze sygnałem jest spadek stężenia cGMP, a w neuronie węchowym wzrost stężenia cAMP. Ta sama rodzina kanałów przenosi więc sygnał w przeciwnych kierunkach.

W zmyśle węchu cząsteczka zapachowa wiąże się z receptorem na rzęskach neuronu czuciowego. Receptor aktywuje białko G obecne w neuronach węchowych, oznaczane Golf. Myszy pozbawione tego białka miały silnie osłabioną odpowiedź elektryczną neuronów węchowych na wiele zapachów, a ponad 75% z nich nie potrafiło ssać i ginęło w ciągu 2 dni od urodzenia [32]. Golf włącza cyklazę adenylanową typu 3. U myszy bez tej cyklazy odpowiedź nabłonka węchowego na zapachy zanikła całkowicie, a zwierzęta nie przechodziły testów zachowania opartych na węchu [33]. Cykliczny AMP otwiera kanały CNG, przez które do komórki wpływają kationy, w tym wapń [25]. Napływ wapnia pobudza neuron, a następnie uczestniczy w adaptacji, czyli osłabieniu odpowiedzi na utrzymujący się zapach [25].

2.3.5. Plastyczność synaptyczna i pamięć

Cykliczny AMP uczestniczy w przejściu od pamięci krótkotrwałej do długotrwałej. Kandel wyróżnił w tym przejściu sześć ogniw molekularnych: cAMP, PKA, element odpowiedzi na cAMP w DNA, czynniki transkrypcyjne CREB-1 i CREB-2, czyli białka wiążące element odpowiedzi na cAMP, oraz białko CPEB, które reguluje syntezę białek w synapsie [34]. Pamięć krótkotrwała opiera się na fosforylacji białek już obecnych w synapsie. Pamięć długotrwała wymaga natomiast, by PKA dotarła do jądra komórkowego i uruchomiła przez CREB syntezę nowych białek [34]. Nowe białka przebudowują synapsę i utrwalają wzmocnienie przekaźnictwa.

W hipokampie źródłem cAMP potrzebnego do utrwalenia śladu pamięciowego są cyklazy pobudzane przez wapń. Myszy pozbawione jednocześnie cyklaz AC1 i AC8 nie wykazywały późnej fazy długotrwałego wzmocnienia synaptycznego ani pamięci długotrwałej [35]. Myszy pozbawione tylko jednej z tych cyklaz zachowywały obie funkcje [35]. Podanie forskoliny do pola CA1 hipokampa przed treningiem przywracało pamięć długotrwałą, co wskazuje, że brakującym ogniwem był sam wzrost stężenia cAMP [35]. Z doświadczeń tych wynika, że cyklazy wrażliwe na wapń tłumaczą aktywność neuronu na trwałą zmianę budowy synapsy.

2.3.6. Transport jonów i wody w nabłonku

Cykliczny GMP reguluje ilość soli i wody wydzielanej do światła jelita. Receptorem sygnału jest cyklaza GC-C, obecna głównie na nabłonku jelita [36]. Pobudzają ją peptydy wytwarzane przez samo jelito, guanylina i uroguanylina [37]. Związanie peptydu podnosi stężenie cGMP w komórce nabłonka. Cykliczny GMP prowadzi do fosforylacji kanału chlorkowego CFTR, a otwarty kanał wydziela chlorki do światła jelita [37]. Za chlorkami przechodzi sód i woda, co nawilża treść jelitową.

Rodzinne mutacje genu GC-C dowiodły, że ten sygnał jest niezbędny dla równowagi płynów i elektrolitów w jelicie noworodka [36]. Szlak działa także poza jelitem. Uroguanylina krąży we krwi i w nerce zwiększa wydalanie sodu i potasu [37]. U myszy GC-C wpływa też na skład mikrobioty jelitowej i na przebieg zapalenia jelita grubego [36]. Ten sam peptyd działa więc w jelicie i w nerce, czyli w dwóch narządach decydujących o bilansie sodu.

2.4. Regulacja stężenia i zmienność

Stężenie cAMP i cGMP w danym miejscu komórki jest wynikiem trzech procesów: syntezy przez cyklazy, rozkładu przez fosfodiesterazy i usuwania na zewnątrz. Oba nukleotydy nie są wydzielane jak hormony, więc ich zmienność wynika z bodźców działających na komórkę, a nie z rytmu wydzielania. Stężenie zmienia się przy tym nierównomiernie w obrębie jednej komórki. Dawny model zakładał liniową drogę od receptora do efektora przez jednolicie rosnące stężenie cAMP [7]. Obecny model opisuje cAMP jako sieć lokalnych mikrodomen, w których stężenie zależy od miejscowej syntezy i rozkładu [7].

Rusztowaniem tych mikrodomen są białka AKAP, czyli białka kotwiczące kinazę A. Zatrzymują one w jednym miejscu komórki PKA razem z innymi enzymami sygnałowymi, w tym z fosfodiesterazami [38]. Holoenzymy PKA związane z AKAP tworzą odrębne ogniska sygnalizacji [9]. Dzięki temu hormon podnoszący cAMP przy błonie nie musi zmieniać aktywności PKA w jądrze komórkowym.

Najważniejszym narzędziem regulacji są fosfodiesterazy. Tworzą one 11 rodzin, różniących się budową, kinetyką, sposobem regulacji, położeniem w komórce i wrażliwością na inhibitory [3]. Rodziny różnią się też wybiórczością wobec substratu i rozmieszczeniem w tkankach [12]. Najważniejsze cechy rodzin zestawia tabela.

Zestawienie tłumaczy, dlaczego inhibitor jednej rodziny działa w wybranych narządach, a nie w całym organizmie [3, 12].

Szlak nukleotydów cyklicznych wymienia sygnały z sygnalizacją wapniową. Kompleks wapnia z kalmoduliną pobudza cyklazy AC1 i AC8, co w neuronie łączy napływ wapnia z syntezą cAMP [35]. Ten sam kompleks pobudza fosfodiesterazę PDE1, która rozkłada oba nukleotydy [3]. Kanały CNG przepuszczają wapń, a ich czynność modyfikuje kompleks wapnia z kalmoduliną [25]. Sygnał wapniowy może więc zarówno podnieść, jak i obniżyć stężenie cAMP, zależnie od tego, czy komórka zawiera AC1 i AC8, czy PDE1.

Oba nukleotydy wpływają też na siebie nawzajem przez fosfodiesterazy. Cykliczny GMP pobudza allosterycznie PDE2, więc przyspiesza rozkład cAMP [26]. W PDE3 cGMP konkuruje z cAMP o miejsce aktywne, więc spowalnia jego rozkład [26]. W komórkach serca te dwa mechanizmy odpowiadają między innymi za nasilenie prądów wapniowych i za osłabienie odpowiedzi na agonistów receptorów β [26]. Skutek wzrostu cGMP dla sygnału cAMP zależy więc od tego, która fosfodiesteraza przeważa w danej mikrodomenie.

2.5. Inaktywacja i wydalanie

Główną drogą inaktywacji obu nukleotydów jest hydroliza przez fosfodiesterazy. Enzymy te rozcinają wiązanie fosfodiestrowe przy trzecim atomie węgla rybozy, otwierając pierścień [3]. Z cAMP powstaje wtedy 5′-AMP, a z cGMP 5′-GMP, czyli zwykłe nukleotydy bez właściwości przekaźnika. Hydroliza przerywa sygnał, dlatego o czasie trwania odpowiedzi decyduje w dużym stopniu aktywność fosfodiesteraz [3].

Drugą drogą jest aktywny transport na zewnątrz komórki. Prowadzą go białka oporności wielolekowej MRP4, MRP5 i MRP8, zużywające energię [13]. W komórkach przysadki szczura pompy te usuwały większość nowo wytworzonego cGMP, ale tylko niewielką część cAMP [13]. Zmniejszenie ekspresji MRP5 obniżało wypływ cGMP bez wpływu na wypływ cAMP [13]. Dla cGMP transport jest więc w tych komórkach ważnym sposobem kończenia sygnału, a dla cAMP mało istotnym.

Nukleotydy usunięte z komórki nie zawsze są pozbawione działania. Pozakomórkowy cGMP, uwalniany z nabłonka jelita po pobudzeniu GC-C przez leki, jest ważnym mechanizmem zmniejszania bólu brzucha w zespole jelita drażliwego z zaparciami [36]. Część nukleotydów trafia do krwi i do moczu. Oba nukleotydy cykliczne wyizolowano z moczu szczura już w 1963 roku [5]. U ludzi wydalanie cAMP z moczem rośnie po podaniu parathormonu, ponieważ hormon ten pobudza cyklazę adenylanową w nerce [39].

3. Zaburzenia i modyfikacja

3.1. Niedobór – przyczyny i następstwa

Niedobór nukleotydu cyklicznego oznacza, że komórka nie wytwarza go w odpowiedzi na bodziec, choć sam bodziec jest prawidłowy. Przyczyną bywa wrodzony defekt białka Gs albo cyklazy. Następstwa ograniczają się do tkanek, w których zmieniony enzym jest niezbędny do przekazania sygnału. Dwa dobrze zbadane przykłady dotyczą przytarczyc i siatkówki.

Rzekoma niedoczynność przytarczyc typu 1a jest chorobą, w której tkanki nie reagują na parathormon. Stężenie wapnia we krwi jest niskie, a fosforanów wysokie, mimo że parathormon krąży we krwi w zwiększonym stężeniu [39, 40]. Przyczyną są dziedziczone od matki mutacje inaktywujące genu GNAS, kodującego podjednostkę α białka Gs [40]. Nerka i kość otrzymują sygnał hormonu, ale nie potrafią przetworzyć go na cAMP. W 1969 roku Chase, Melson i Aurbach pokazali, że po wlewie parathormonu wydalanie cAMP z moczem rośnie u osób zdrowych, a u chorych pozostaje niskie [39]. Autorzy uznali, że przyczyną jest brak lub wadliwa postać cyklazy adenylanowej wrażliwej na parathormon [39]. U chorych oporność obejmuje często także tyreotropinę, inny hormon działający przez cAMP [41]. Obrazowi hormonalnemu towarzyszą niski wzrost, skrócenie kości, wczesna otyłość i ogniska kostnienia poza szkieletem [41]. Te same mutacje odziedziczone od ojca dają rzekomo-rzekomą niedoczynność przytarczyc, czyli zmiany budowy ciała bez oporności na hormon [40].

Wrodzona ślepota Lebera jest najwcześniejszą i najcięższą postacią dziedzicznej choroby siatkówki, odpowiadającą za co najmniej 5% dziedzicznych dystrofii siatkówki [30]. Jej postać LCA1 wywołują mutacje genu siatkówkowej cyklazy guanylanowej, oznaczanego dziś GUCY2D [30]. Fotoreceptor wytwarza wtedy za mało cGMP, więc kanały CNG pozostają trwale zamknięte [30]. Komórka zachowuje się tak, jakby stale padało na nią światło, i nie przekazuje zmian oświetlenia. Dziecko jest niewidome lub bardzo słabo widzi od urodzenia, a elektroretinogram nie rejestruje odpowiedzi siatkówki [30].

3.2. Nadmiar – przyczyny i następstwa

Nadmiar nukleotydu cyklicznego powstaje, gdy cyklaza pracuje bez przerwy, niezależnie od bodźca. Przyczyną bywa trwała aktywacja białka Gs, wrodzona albo wywołana toksyną bakteryjną. Następstwa zależą od tkanki: w gruczołach dokrewnych nadmiar cAMP pobudza wydzielanie i podziały komórek, a w nabłonku jelita wydzielanie wody.

Zespół McCune’a-Albrighta jest chorobą sporadyczną, w której występują wieloogniskowa dysplazja włóknista kości, plamy barwnikowe koloru kawy z mlekiem, przedwczesne dojrzewanie płciowe i nadczynność kilku gruczołów dokrewnych [42]. W 1991 roku u czterech chorych wykryto somatyczne mutacje aktywujące genu podjednostki α białka Gs, zamieniające argininę w pozycji 201 na histydynę lub cysteinę [42]. Zmienione białko Gs pobudza cyklazę stale, więc komórki z mutacją wytwarzają nadmiar cAMP [42]. Mutacja powstaje prawdopodobnie we wczesnym okresie rozwoju zarodkowego, dlatego ciało chorego jest mozaiką komórek prawidłowych i zmienionych [42]. Odsetek zmienionych komórek różnił się między tkankami i był największy w ogniskach nieprawidłowego rozrostu [42].

Toksyny bakteryjne wywołują nadmiar nukleotydów w nabłonku jelita. Toksyna cholery modyfikuje białko Gs tak, że pozostaje ono trwale aktywne, więc cyklaza adenylanowa w komórkach nabłonka jelita pracuje bez przerwy [43]. Wysokie stężenie cAMP pobudza wydzielanie chlorków i wody do światła jelita, co daje obfitą biegunkę wodnistą [44]. Enterotoksyna ciepłostała Escherichia coli wiąże się z cyklazą GC-C w miejscu guanyliny i podnosi stężenie cGMP, co prowadzi do tego samego skutku, biegunki wydzielniczej [36]. Toksyna krztuśca działa na białka Gi i Go, odłączając je od receptorów, więc receptory hamujące przestają obniżać stężenie cAMP [45].

Przewlekłe pobudzenie szlaku cAMP szkodzi też sercu. U myszy z nadmierną ekspresją receptora β1 w sercu kurczliwość była w młodym wieku większa, ale pole przekroju komórek mięśniowych wzrosło 3,5-krotnie [46]. U myszy w wieku 35 tygodni kurczliwość była mniejsza o około 50%, a frakcja wyrzutowa spadała nawet do około 20% [46]. U tych zwierząt krótkotrwały wzrost sygnału poprawiał więc pracę serca, a długotrwały prowadził do jego niewydolności.

3.3. Rola cAMP oraz cGMP w patogenezie chorób

W wielu chorobach stężenie nukleotydu może być prawidłowe, a zawodzi białko, które go wytwarza, odczytuje albo rozkłada. Szlak cAMP i cGMP jest wtedy ogniwem patogenezy, choć pomiar samego nukleotydu nie wykazałby odchyleń. Najwyraźniej widać to w grupie chorób przypominających rzekomą niedoczynność przytarczyc.

Sieć EuroPHP zaproponowała dla tych chorób wspólną nazwę: zaburzenie inaktywujące sygnalizację parathormonu i białka podobnego do parathormonu, w skrócie iPPSD [47]. Podział obejmuje sześć typów, uporządkowanych według ogniwa szlaku, które uległo uszkodzeniu [47]. Kolejne typy dotyczą receptora parathormonu, białka Gs, metylacji locus GNAS, podjednostki regulatorowej PKA oraz dwóch fosfodiesteraz. Uszkodzenie różnych ogniw tego samego szlaku daje choroby o częściowo wspólnym obrazie, dlatego klasyfikacja grupuje je razem [47].

Zestawienie pokazuje, że klasyfikacja iPPSD porządkuje choroby według miejsca w szlaku, a nie według objawów [47]. Typy od czwartego do szóstego dotyczą białek działających za cyklazą, czyli kinazy odczytującej cAMP i enzymów rozkładających ten nukleotyd [47].

Podobny mechanizm dotyczy kanałów odczytujących cGMP w siatkówce. Mutacje genów podjednostek kanałów CNG w czopkach wywołują całkowitą lub niepełną achromatopsję, czyli brak widzenia barw, a mutacje w pręcikach zwyrodnienie siatkówki [25]. Mutacje genu cyklazy AC5 powodują hiperkinetyczne zaburzenia ruchowe pozapiramidowe [1]. Zmiany genów PKA, w tym mutacje i fuzje genowe, a także przemieszczenie kinazy poza białka AKAP, wiążą się z rosnącą liczbą nowotworów złośliwych [48].

W niewydolności serca układ współczulny jest pobudzony, a liczba i czynność receptorów β w sercu maleją [28]. Nie rozstrzygnięto, czy te zmiany chronią serce, czy mu szkodzą [28]. W naczyniach stres oksydacyjny utlenia żelazo hemu w rozpuszczalnej cyklazie guanylanowej albo usuwa hem z enzymu [8]. Utleniona cyklaza przestaje reagować na tlenek azotu, więc wytwarzanie cGMP spada mimo prawidłowej syntezy tego gazu [8].

Szlak cAMP łączy się też z hipotezą molekularną depresji. Hipoteza zakłada, że długotrwałe leczenie przeciwdepresyjne utrzymuje aktywność szlaku cAMP i czynnika transkrypcyjnego CREB w hipokampie i korze [49]. Wzrasta wtedy ekspresja czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF), białka podtrzymującego przeżycie neuronów, którą stres obniża [49]. W badaniu pozytonowej tomografii emisyjnej wiązanie znacznika fosfodiesterazy PDE4 było u 44 nieleczonych chorych o około 20% mniejsze niż u 35 osób zdrowych [50]. Po około 8 tygodniach leczenia inhibitorem wychwytu zwrotnego serotoniny wiązanie wzrosło o 12% u 23 chorych [50]. Wynik nie korelował jednak z nasileniem objawów ani z ich poprawą [50].

3.4. Punkt uchwytu leków

Wiele leków działa przez zmianę stężenia cAMP lub cGMP, choć ich punktem uchwytu jest receptor, cyklaza albo fosfodiesteraza. Leki można uporządkować według tego, które ogniwo szlaku zmieniają. Skutek zależy od rodziny enzymu i od tkanki, w której ta rodzina przeważa. Programy rozwoju leków działających na fosfodiesterazy obejmują choroby układu nerwowego i krążenia, odporności, nowotwory i zaburzenia przemian, a dotąd skupiały się na hamowaniu aktywności katalitycznej enzymu [51].

Inhibitory fosfodiesterazy typu 5 spowalniają rozkład cGMP w mięśniach gładkich. Syldenafil, pierwszy wybiórczy inhibitor PDE5, badano początkowo jako lek na dławicę piersiową, a w ciągu niespełna 20 lat wprowadzono go w leczeniu zaburzeń erekcji i nadciśnienia płucnego [52]. W metaanalizie sieciowej 10 badań z randomizacją u 1492 mężczyzn z zaburzeniami erekcji po urazie rdzenia kręgowego inhibitory PDE5 poprawiały erekcję ponad czterokrotnie częściej niż placebo [53]. Azotany dostarczają tlenku azotu, więc zwiększają syntezę cGMP [11]. Łączenie azotanów z inhibitorami PDE5 było w konsensusie PRINCETON IV przedmiotem osobnej oceny bezpieczeństwa [54].

Inhibitory fosfodiesterazy typu 4 podnoszą stężenie cAMP w komórkach zapalnych. W dwóch badaniach z randomizacją u 3091 chorych na przewlekłą obturacyjną chorobę płuc roflumilast zmniejszył częstość umiarkowanych i ciężkich zaostrzeń o 17% [55]. Działania niepożądane występowały częściej niż przy placebo (67% wobec 62%), a różnica masy ciała wobec placebo wyniosła po roku 2,17 kg [55].

Inhibitory fosfodiesterazy typu 3 podnoszą stężenie cAMP w sercu i w płytkach krwi. W badaniu PROMISE u 1088 chorych z ciężką przewlekłą niewydolnością serca doustny milrinon zwiększył śmiertelność ogólną o 28%, a u chorych z najcięższymi objawami o 53% [56]. Cilostazol wydłuża natomiast dystans marszu w chromaniu przestankowym. W przeglądzie Cochrane obejmującym 16 badań z randomizacją dystans do wystąpienia bólu, oceniony łącznie w sześciu z nich, był o 26,5 m dłuższy niż przy placebo [57]. Iloraz szans bólu głowy wyniósł jednak 2,83 [57].

Stymulatory rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej działają na enzym z hemem zawierającym żelazo dwuwartościowe, czyli na postać wrażliwą na tlenek azotu [8]. Aktywatory działają na enzym utleniony lub pozbawiony hemu [8]. W badaniu PATENT-1 u 443 chorych z tętniczym nadciśnieniem płucnym riocyguat wydłużył dystans 6-minutowego marszu o 36 m względem placebo [58]. W badaniu VICTORIA u 5050 chorych z niewydolnością serca z obniżoną frakcją wyrzutową wericyguat zmniejszył częstość zgonu sercowo-naczyniowego lub pierwszej hospitalizacji z powodu niewydolności serca z 38,5% do 35,5% [59]. Nie zmniejszył jednak istotnie samej śmiertelności sercowo-naczyniowej [59].

Linaklotyd jest peptydem pobudzającym cyklazę GC-C w jelicie, który prawie się nie wchłania [60]. W badaniu z randomizacją u 804 chorych z zespołem jelita drażliwego z zaparciami kryterium odpowiedzi spełniło 33,7% chorych leczonych linaklotydem i 13,9% otrzymujących placebo [60]. Leki blokujące receptory β zmniejszają wytwarzanie cAMP w sercu i stanowią najważniejszy postęp w leczeniu niewydolności serca, choć sposób ich korzystnego działania pozostaje przedmiotem sporu [28]. Teofilina, metyloksantyna, rozszerza oskrzela przez hamowanie PDE3, a jej działanie przeciwzapalne może wynikać z hamowania PDE4 [61]. Nudności i bóle głowy wiążą się z hamowaniem fosfodiesteraz, a zaburzenia rytmu i drgawki przy wyższych stężeniach z blokadą receptorów adenozynowych A1 [61].

Tabela porządkuje leki według ogniwa szlaku, a nie według choroby [3, 11]. Wyniki badań PROMISE i VICTORIA pokazują, że podniesienie stężenia nukleotydu nie przesądza o korzyści klinicznej, która zależy od tkanki i czasu działania leku.

3.5. Wsparcie suplementacyjne

Kilka substancji dostępnych w postaci suplementów zmienia stężenie cAMP lub cGMP w doświadczeniach na komórkach i zwierzętach. Działają przez te same ogniwa co leki: pobudzają cyklazę albo hamują fosfodiesterazy. Forskolina aktywuje cyklazę adenylanową bezpośrednio i w skrawkach kory mózgu szczura podnosiła stężenie cAMP 35-krotnie [62]. Winpocetyna jest silnym inhibitorem PDE1, stosowanym jako lek w chorobach naczyń mózgowych [63]. Ikaryna, składnik czynny wyciągu z Epimedium brevicornum, hamowała ludzką PDE5 in vitro ze stężeniem połowiczego hamowania 5,9 µmol/l, a syldenafil 74 nmol/l [64]. Resweratrol hamował kompetycyjnie fosfodiesterazy rozkładające cAMP, a u myszy efekty metaboliczne resweratrolu odtwarzał inhibitor PDE4 [65]. Kwercetyna hamowała PDE4 i fosfolipazę Cβ oraz rozkurczała tchawicę myszy [66].

Informacje dotyczące wskazanych substancji opierają się na danych in vitro lub badań na zwierzętach, a badań mierzących zmianę stężenia nukleotydów cyklicznych u ludzi po tych substancjach brakuje w przytoczonych pracach. Kofeina, choć należy do metyloksantyn, w stężeniach mózgowych osiąganych po wypiciu kawy, rzędu zaledwie mikromoli, działa głównie jako antagonista receptorów adenozynowych [67]. U szczurów pijących roztwór kofeiny przez 3 tygodnie jej stężenie w hipokampie wynosiło około 22 µmol/l [67].

4. Na co warto zwrócić uwagę

Pomiar cAMP wykorzystano w diagnostyce chorób przede wszystkim w rzekomej niedoczynności przytarczyc. Test Chase’a mierzył wydalanie cAMP z moczem po wlewie parathormonu i w 1969 roku autorzy uznali go za dokładny i czuły wskaźnik rozpoznania rzekomej niedoczynności przytarczyc [39]. Pierwszy międzynarodowy konsensus z 2018 roku opiera natomiast rozpoznanie na kryteriach głównych: oporności na parathormon, kostnieniu pozaszkieletowym, krótkopalczastości i wczesnej otyłości [41]. Rozpoznanie kliniczne i laboratoryjne potwierdza badanie genetyczne [41]. Oznaczenie nukleotydu w moczu nie jest więc dziś podstawą rozpoznania tej choroby.

Pojedynczy pomiar cAMP w komórce lub we krwi mówi niewiele o sygnale, który dociera do konkretnego białka. Model mikrodomen zakłada, że skutek czynnościowy zależy od lokalnego stężenia cAMP i od włączenia wybranych gałęzi sieci sygnałowej [7]. Średnie stężenie w całej komórce może więc pozostać bez zmian, gdy w jednej mikrodomenie przy błonie sygnał jest silny. Z tego samego powodu ten sam lek podnoszący cAMP może działać odmiennie w dwóch komórkach tej samej tkanki.

Działanie substancji roślinnych na cyklazy i fosfodiesterazy opisano głównie w probówce, w stężeniach mikromolowych. Forskolina aktywowała cyklazę w błonach kory mózgu szczura z połową efektu maksymalnego przy stężeniu 5–10 µmol/l [62]. Takie wyniki pokazują punkt uchwytu, ale nie mówią, czy podobne stężenie powstaje w tkankach człowieka po spożyciu preparatu. Dla forskoliny, ikaryny, resweratrolu i kwercetyny przytoczone prace nie zawierają pomiarów nukleotydów cyklicznych u ludzi.

Szczególnej uwagi wymaga szlak cGMP w naczyniach. Azotany zwiększają syntezę cGMP, a inhibitory PDE5 spowalniają jego rozkład, więc oba mechanizmy sumują się w rozkurczu naczyń. Konsensus PRINCETON IV poddał osobnej ocenie łączenie tych leków oraz wskazał ryzyko zafałszowania suplementów diety [54]. Według konsensusu suplement diety może zawierać inhibitor PDE5 nieujawniony w składzie [54]. Ten sam konsensus opisał w badaniach retrospektywnych rzadsze niekorzystne zdarzenia sercowe u mężczyzn przyjmujących przewlekle inhibitory PDE5 [54]. Badania retrospektywne nie rozstrzygają jednak, czy to lek chroni serce, czy inne cechy odróżniają osoby, które go przyjmują.

Stosowanie leków i preparatów działających na szlak nukleotydów cyklicznych, zwłaszcza łączenie ich z azotanami, wymaga konsultacji lekarskiej.