Limfocyty pomocnicze Th1, Th2, Th17 i regulatorowe

1. Profil komórek

1.1. Definicja i miejsce w klasyfikacji

Limfocyty pomocnicze (ang. helper T cells, Th) to limfocyty T noszące na powierzchni cząsteczkę CD4. Po rozpoznaniu antygenu nie zabijają one komórek docelowych, lecz wydzielają cytokiny kierujące pracą innych komórek odpornościowych [1]. Wydzielany zestaw cytokin nie jest ten sam u wszystkich tych komórek, a jego skład wyznacza nazwy podtypów: Th1, Th2, Th17 oraz limfocyty regulatorowe [1, 2]. Nazwy te odnoszą się do stanu czynnościowego, w jakim komórka znalazła się po zetknięciu z antygenem. Nie oznaczają one osobnej linii rozwojowej z własnym prekursorem w szpiku [1].

W klasyfikacji limfocytów pomocnicze komórki CD4 stoją obok limfocytów T cytotoksycznych CD8 i razem z nimi tworzą komórkową część swoistej odpowiedzi immunologicznej. Obie grupy rozpoznają antygen przez receptor TCR, czyli receptor limfocytu T, powstający w wyniku przebudowy genów w każdej komórce osobno. Różni je cząsteczka prezentująca antygen. Komórki CD4 odczytują fragmenty białek ułożone w rowku cząsteczki głównego układu zgodności tkankowej klasy II, a komórki CD8 w cząsteczce klasy I.

Od limfocytów cytotoksycznych limfocyty pomocnicze różnią się narzędziem działania, a nie siłą odpowiedzi. Komórka cytotoksyczna zabija komórkę zakażoną przez kontakt, natomiast komórka pomocnicza działa na odległość wydzielaną cytokiną [1]. Od wrodzonych komórek limfoidalnych, które wydzielają podobne cytokiny, odróżnia je obecność przebudowanego receptora antygenowego. Komórki wrodzone takiego receptora nie mają i odpowiadają na sygnał tkankowy, nie na konkretny antygen [3]. Dawna nazwa „limfocyty supresorowe” określała aktywność hamującą, której nie dawało się wtedy przypisać wyodrębnionej populacji komórek. Dzisiejsze limfocyty regulatorowe są rozpoznawane po czynniku transkrypcyjnym FOXP3 i po cząsteczce CD25 [4].

Zakres pojęcia obejmuje cztery szeroko opisane stany czynnościowe: Th1, Th2, Th17 i limfocyty regulatorowe. Piątą pozycję zajmują pomocnicze limfocyty grudkowe Tfh, wyodrębnione ze względu na pomoc udzielaną limfocytom B w grudkach chłonnych [5]. Wybór stanu czynnościowego rozstrzyga o przebiegu odpowiedzi na ten sam antygen. Ten sam drobnoustrój wywołuje obronę skuteczną albo zapalenie uszkadzające tkankę, zależnie od tego, jakie cytokiny przeważyły w pierwszych dniach po rozpoznaniu antygenu [1].

1.2. Morfologia i markery rozpoznawcze

Limfocyt pomocniczy jest niewielką komórką okrągłego kształtu, z dużym jądrem i wąskim rąbkiem cytoplazmy, w której organelli jest mało. Pod mikroskopem świetlnym wygląda tak samo jak limfocyt cytotoksyczny i tak samo jak każdy z jego podtypów czynnościowych. Rozpoznanie opiera się więc na białkach, a nie na wyglądzie: na cząsteczkach powierzchniowych, na wydzielanych cytokinach i na czynnikach transkrypcyjnych wewnątrz komórki [1].

Zestaw podstawowy tworzą trzy cząsteczki powierzchniowe. Kompleks CD3 przenosi sygnał z receptora TCR do wnętrza komórki. Sam receptor TCR rozpoznaje fragment białka w cząsteczce zgodności tkankowej, a cząsteczka CD4 ten kontakt stabilizuje. Limfocyty regulatorowe mają dodatkowo dużo cząsteczki CD25, czyli łańcucha alfa receptora interleukiny 2. Sama obecność CD25 nie wystarcza jednak do ich wyodrębnienia, bo pojawia się ona na każdym świeżo pobudzonym limfocycie. Pomocna okazała się cząsteczka CD127, czyli receptor interleukiny 7, którego ilość na limfocytach regulatorowych jest mała. W badaniu komórek krwi ludzkiej wybranie komórek CD4 o małej ilości CD127 dało populację FOXP3-dodatnią, hamującą podziały innych limfocytów [6]. Populacja ta była trzykrotnie liczniejsza od klasycznej frakcji CD4 z dużą ilością CD25 [6].

Podtypy czynnościowe różnią się też receptorami chemokinowymi, czyli białkami odczytującymi sygnały nawigacyjne w tkankach. Ludzkie limfocyty Th1 mają receptory CXCR3 i CCR5, a limfocyty Th2 receptor CCR4 i w mniejszym stopniu CCR3 [7]. Limfocyty Th17 pamięci wyróżnia jednoczesna obecność receptorów CCR6 i CCR4 [8]. Komórki z receptorami CCR6 i CXCR3 wydzielają natomiast zarówno interferon gamma, jak i interleukinę 17 [8]. Zestaw receptorów wiąże więc fenotyp komórki z miejscem, do którego trafi.

Najpewniejszym znacznikiem stanu czynnościowego jest czynnik transkrypcyjny, czyli białko włączające geny cytokin. Limfocyty Th1 mają czynnik T-bet, którego wprowadzenie do spolaryzowanych komórek Th2 uruchamiało wytwarzanie interferonu gamma i wyciszało interleukiny 4 i 5 [9]. Limfocyty Th2 mają czynnik GATA3, wystarczający do włączenia genów cytokin typu 2 i potrzebny do ich ekspresji [10]. Limfocyty Th17 mają czynnik RORγt, bez którego komórki wytwarzające interleukinę 17 nie powstają [11]. Limfocyty regulatorowe mają czynnik FOXP3, którego brak znosi ich rozwój, a wprowadzenie nadaje limfocytom obojętnym zdolność hamowania [12, 13]. Oznaczenie czynnika transkrypcyjnego rozstrzyga zatem przynależność komórki lepiej niż pojedyncza cząsteczka powierzchniowa.

1.3. Pochodzenie i różnicowanie

Limfocyty pomocnicze powstają z komórek macierzystych szpiku, a dojrzewają w grasicy. Tam młody tymocyt przebudowuje geny receptora TCR i zostaje sprawdzony w dwóch krokach. Selekcja pozytywna zatrzymuje komórki, których receptor wiąże własne cząsteczki zgodności tkankowej z umiarkowaną siłą [14]. Selekcja negatywna usuwa te, które wiążą własne peptydy zbyt mocno [14]. Kontakt z peptydem pochodzącym z białek własnych o średniej sile wiązania kieruje część tymocytów CD4 na inną drogę. Powstają z nich limfocyty regulatorowe grasicze, gotowe do hamowania odpowiedzi, zanim opuszczą narząd [4, 14].

Komórka, która przeszła selekcję, opuszcza grasicę jako limfocyt obojętny, czyli taki, który antygenu jeszcze nie spotkał. Krąży ona między krwią a narządami limfatycznymi i nie wydziela cytokin efektorowych. Zestawu cytokin nie ma jeszcze przypisanego, a wybór zapada dopiero w węźle chłonnym, w chwili gdy komórka prezentująca antygen pokazuje jej fragment białka [1].

Przebieg tego wyboru rozstrzyga się na poziomie cząsteczek w ciągu pierwszych podziałów komórki. Stanem wyjściowym jest limfocyt obojętny z czynnikami transkrypcyjnymi w ilościach śladowych. Bodźcem jest jednoczesne pobudzenie receptora TCR i receptora cytokiny obecnej w otoczeniu. Kinazy związane z receptorem cytokiny uruchamiają białka STAT, a te włączają gen czynnika głównego dla danego podtypu. Czynnik główny otwiera dostęp do genów swoich cytokin i równocześnie wycisza geny podtypów konkurencyjnych [1, 9]. Stanem końcowym jest komórka, która po kolejnym spotkaniu z antygenem wydziela ten sam zestaw cytokin bez dodatkowego sygnału z otoczenia. Konsekwencją jest utrwalenie kierunku odpowiedzi na wiele dni, a nie tylko na czas trwania pierwszego pobudzenia.

Klasyczny przykład takiego rozstrzygnięcia opisano dla limfocytów Th1. Makrofagi zetknięte z bakterią Listeria monocytogenes wydzielały interleukinę 12, a ta kierowała obojętne limfocyty myszy w stronę wytwarzania interferonu gamma [15]. Droga powstawania limfocytów regulatorowych nie zamyka się natomiast w grasicy. Transformujący czynnik wzrostu beta, czyli TGF-β, działa na limfocyt obojętny równocześnie z pobudzeniem receptora TCR. W takim układzie włączał on gen FOXP3 i nadawał komórce zdolność hamowania podziałów innych limfocytów [16]. Powstają w ten sposób limfocyty regulatorowe obwodowe, a repertuar komórek hamujących uzupełnia się poza grasicą w ciągu całego życia [4].

1.4. Rozmieszczenie i liczebność

Limfocyty pomocnicze krążą we krwi, wypełniają strefy grudkowe węzłów chłonnych i śledziony, a po pobudzeniu wchodzą do tkanek objętych zapaleniem. Krew zawiera jednak mniejszość tych komórek, bo większość przebywa w narządach limfatycznych i w błonach śluzowych. Liczby oznaczane w krwi opisują więc pulę krążącą, dostępną do pobrania, a nie całą populację w organizmie.

Rozkład podtypów zmierzono u 150 zdrowych dorosłych narodowości Han w chińskiej prowincji Shanxi, w wieku od 20 do 70 lat, metodą cytometrii przepływowej [17]. Wyniki poniżej obejmują 95 procent tej populacji i pochodzą z jednej grupy etnicznej oraz z jednego laboratorium.

Rozpiętość zakresów jest zatem wielokrotnie większa dla limfocytów Th1 niż dla pozostałych podtypów. Stosunek Th1 do Th2 mieścił się w tej grupie między 0,59 a 52,37 [17]. Liczba limfocytów regulatorowych rosła z wiekiem, a najniższe wartości stwierdzono u młodszych kobiet [17]. Pojedynczy wynik odsetkowy niesie więc mało informacji bez odniesienia do grupy o tym samym wieku i tej samej płci.

Rozmieszczenie tkankowe nie jest przypadkowe i różni się między podtypami. Limfocyty Th17 przebywają na stałe w blaszce właściwej błony śluzowej jelita [11]. U myszy pozbawionych czynnika RORγt oraz u myszy bez interleukiny 6 komórek tych w jelicie nie ma [11]. Zasiedlenie jelita myszy jedną bakterią komensalną, nitkowatą bakterią segmentowaną, wystarczyło do pojawienia się limfocytów Th17 w blaszce właściwej jelita cienkiego [18]. Mikroflora jelitowa współdecyduje więc o tym, ile komórek danego podtypu znajduje się w błonie śluzowej. U ludzi ten konkretny gatunek bakterii nie został jako czynnik sprawczy potwierdzony.

1.5. Rys historyczny

Do połowy lat osiemdziesiątych limfocyty pomocnicze uchodziły za jedną populację, która po rozpoznaniu antygenu wytwarza ten sam zestaw czynników wspierających inne komórki. Rozstrzygnięcie przyniosła praca Mosmanna i Coffmana z 1986 roku. Klony limfocytów pomocniczych myszy rozdzieliły się w niej na dwa typy o powtarzalnych profilach wydzielania. Typ pierwszy wydzielał interleukinę 2 i interferon gamma, a typ drugi czynnik BSF1, znany dziś jako interleukina 4 [2]. Oba typy pomagały limfocytom B, lecz robiły to inaczej, więc podział dotyczył sposobu pomocy, a nie jej obecności [2].

Drugim rozstrzygnięciem było wskazanie komórek hamujących. Wcześniej aktywność hamującą opisywano bez powiązania z wyodrębnioną populacją, a po nieudanych próbach jej wyizolowania pojęcie straciło wiarygodność. Zespół Sakaguchiego wykazał w 1995 roku, że około 10 procent obwodowych limfocytów CD4 myszy nosi cząsteczkę CD25 [19]. Przeniesienie limfocytów pozbawionych tej frakcji do myszy bezgrasiczych wywoływało zapalenie tarczycy, żołądka, trzustki i innych narządów [19]. Genetyczne domknięcie przyszło w 2001 roku, gdy zespół Bennetta powiązał zespół IPEX z mutacjami genu FOXP3 [20].

Trzecie rozstrzygnięcie odwróciło obraz autoimmunizacji. Zapalenie mózgu w modelu doświadczalnym przypisywano interleukinie 12 i zależnym od niej limfocytom Th1. Wyniki uzyskiwano wtedy na myszach pozbawionych podjednostki p40 i na przeciwciałach przeciw tej podjednostce, wspólnej dla interleukin 12 i 23. Zespół Cua użył w 2003 roku myszy pozbawionych wyłącznie interleukiny 23. Czynnikiem krytycznym w tym modelu okazała się interleukina 23, a dotychczasową rolę interleukiny 12 zinterpretowano błędnie [21]. Dwa lata później zespoły Harringtona i Parka opisały komórki wytwarzające interleukinę 17 jako odrębny stan czynnościowy [22, 23]. Powstawał on niezależnie od czynników wymaganych przez limfocyty Th1 i Th2 [22, 23]. Czteroczłonowy podział używany dzisiaj powstał więc przez kolejne poprawki, a nie przez jedno odkrycie.

2. Czynność komórki

2.1. Receptory i sygnały odbierane

Limfocyt pomocniczy odczytuje otoczenie trzema rodzajami białek powierzchniowych naraz. Receptor TCR rozpoznaje antygen, cząsteczki kostymulujące potwierdzają, że antygen pochodzi z miejsca zagrożenia, a receptory cytokin przekazują informację o rodzaju zagrożenia. Dopiero zgodność tych trzech sygnałów uruchamia podziały komórki i wytwarzanie cytokin.

Sygnał pierwszy powstaje na styku z komórką prezentującą antygen. Receptor TCR wiąże fragment obcego białka ułożony w cząsteczce zgodności tkankowej klasy II. Kinazy związane z kompleksem CD3 przenoszą to zdarzenie na białka wnętrza komórki [1]. Sygnał sam nie wystarcza, bo bez potwierdzenia limfocyt przechodzi w stan braku odpowiedzi. Potwierdzenie daje cząsteczka CD28, wiążąca białka B7 na dojrzałej komórce prezentującej antygen. Różnicowanie komórek wytwarzających interleukinę 17 wymagało u myszy zarówno cząsteczki CD28, jak i cząsteczki ICOS [23]. Od czynników potrzebnych limfocytom Th1 i Th2 nie zależało [23].

Sygnał trzeci, czyli cytokina obecna w otoczeniu, rozstrzyga o kierunku odpowiedzi. Każdy receptor cytokiny działa przez własne białko STAT, czyli przekaźnik sygnału i aktywator transkrypcji [1]. Białko to po fosforylacji przechodzi do jądra i włącza gen czynnika głównego [1]. Receptor interleukiny 12 działa przez białko STAT4 i wspiera czynnik T-bet. Receptor interleukiny 4 działa przez białko STAT6 i wspiera czynnik GATA3, a receptory interleukin 6 i 23 przez białko STAT3 i wspierają czynnik RORγt [1]. Receptor transformującego czynnika wzrostu beta uruchamia natomiast białka SMAD, które sprzyjają genowi FOXP3 [16]. Ta odrębność szlaków wyjaśnia, dlaczego usunięcie jednego białka STAT znosi jeden kierunek odpowiedzi, a pozostałych nie dotyka [22].

Dwa receptory pełnią rolę szczególną. Receptor interleukiny 2, którego łańcuchem alfa jest cząsteczka CD25, odbiera czynnik wzrostu potrzebny limfocytom regulatorowym do przeżycia [4]. Jego duża ilość na tych komórkach pozwala im przechwytywać interleukinę 2 z otoczenia [4]. Receptor ST2 wiąże interleukinę 33, cytokinę uwalnianą z komórek uszkodzonych, i występuje przede wszystkim na limfocytach Th2 oraz na mastocytach [24]. Limfocyt Th2 odpowiada więc nie tylko na antygen, ale i na sam fakt uszkodzenia bariery [24]. Jego pobudzenie wiąże się zatem z urazem tkanki, a nie wyłącznie z zakażeniem [24].

2.2. Wydzielane mediatory

Cytokina jest jedynym narzędziem, jakim limfocyt pomocniczy dysponuje wobec komórek odległych. Wydziela ją po ponownym rozpoznaniu antygenu, przez kilka godzin i tylko w najbliższym otoczeniu. Cząsteczki te szybko ulegają rozkładowi i działają na krótkim dystansie. Zestaw wydzielanych cytokin jest u komórki spolaryzowanej powtarzalny i stanowi podstawę nazw podtypów [2].

Limfocyty Th1 wydzielają interferon gamma, interleukinę 2 oraz czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów, oznaczany skrótem GM-CSF [2]. Interferon gamma jest wśród nich cytokiną rozpoznawczą, bo zmienia zachowanie makrofagów i nasila przedstawianie antygenów. Limfocyty Th2 wydzielają interleukiny 4, 5 i 13, a każda z nich ma innego odbiorcę. Interleukina 4 działa na limfocyty B i na sam limfocyt Th2, interleukina 5 na granulocyty kwasochłonne, a interleukina 13 na komórki nabłonka i mięśni gładkich [1].

Limfocyty Th17 wydzielają interleukiny 17A i 17F oraz interleukinę 22 [18]. Interleukiny 17 działają na komórki nabłonka i fibroblasty, pobudzając je do wytwarzania chemokin ściągających granulocyty obojętnochłonne oraz peptydów przeciwbakteryjnych. Interleukina 22 działa niemal wyłącznie na komórki nabłonka i wzmacnia barierę, nie pobudzając przy tym leukocytów. Część ludzkich limfocytów pamięci z receptorami CCR6 i CXCR3 wydziela jednocześnie interleukinę 17 i interferon gamma [8]. Zestawy cytokin obu podtypów nie wykluczają się więc w jednej komórce [8].

Limfocyty regulatorowe wydzielają interleukinę 10 i transformujący czynnik wzrostu beta, czyli cytokiny hamujące podziały i wydzielanie u innych limfocytów [4]. Komórki, w których czynnik FOXP3 powstał pod wpływem tego czynnika wzrostu, same go wydzielają i hamują podziały limfocytów obojętnych w warunkach doświadczalnych [16]. Pomocnicze limfocyty grudkowe Tfh wydzielają natomiast interleukinę 21, która pobudza podziały limfocytów B i ich przejście w komórki wydzielające przeciwciała [5]. Zestaw cytokin wskazuje więc adresata odpowiedzi ściślej niż nazwa podtypu.

2.3. Stany czynnościowe i fenotypy

Stan czynnościowy limfocytu pomocniczego to para dwóch rzeczy: czynnik transkrypcyjny czynny w jądrze komórki i zestaw cytokin, które ta komórka wydziela po rozpoznaniu antygenu. Stan ten nie jest cechą wrodzoną komórki, lecz skutkiem sygnałów odebranych w węźle chłonnym. Przełącznikiem są cytokiny wydzielane przez komórki prezentujące antygen, a ich skład zależy od tego, jaki drobnoustrój lub jaki rodzaj uszkodzenia te komórki napotkały [1].

Mechanizm przełączania ma cztery kroki i jeden skutek uboczny. Cytokina wiąże swój receptor na limfocycie obojętnym, białko STAT przenosi sygnał do jądra, czynnik główny zostaje włączony, a jego obecność otwiera geny własnych cytokin. Skutkiem ubocznym jest wygaszenie programów konkurencyjnych, bo czynnik główny hamuje geny czynników pozostałych podtypów [1, 9]. Dlatego komórka raz spolaryzowana wydziela ten sam zestaw cytokin także wtedy, gdy trafi do tkanki o innym składzie sygnałów.

Rozstrzygnięcie między limfocytami Th17 a regulatorowymi zachodzi na jednej rozwidlonej drodze. Transformujący czynnik wzrostu beta działający samotnie włącza gen FOXP3. Ten sam czynnik razem z interleukiną 6 kieruje natomiast komórkę myszy w stronę wytwarzania interleukiny 17, a interleukina 6 całkowicie blokuje przy tym powstawanie komórek FOXP3-dodatnich [25]. W tej samej pracy interleukina 23 nie okazała się czynnikiem różnicującym, a jej rola dotyczy komórek już spolaryzowanych [25]. W pierwszych badaniach komórek ludzkich układ czynników wydawał się inny. Polaryzację w stronę interleukiny 17 uruchamiała w nich interleukina 1β, interleukina 6 ją wzmacniała, a transformujący czynnik wzrostu beta i interleukina 12 ją tłumiły [26]. W hodowli bez surowicy obojętne limfocyty z krwi pępowinowej wymagały jednak do wytwarzania interleukiny 17 łącznie transformującego czynnika wzrostu beta, interleukiny 1β oraz interleukiny 6, 21 albo 23 [64]. Autorzy tej pracy uznali więc drogi różnicowania u myszy i człowieka za podobne [64]. Stan zapalny w tkance przesuwa więc równowagę między komórką hamującą a komórką prozapalną w stronę tej drugiej.

Cztery szeroko opisane stany różnią się przełącznikiem, czynnikiem głównym i zadaniem, jakie pełnią w obronie.

Przypisanie jednego czynnika głównego do jednego zestawu cytokin jest zatem regułą, na której opiera się cały podział. Reguła ta ma jednak dwa ograniczenia, widoczne dopiero w tkankach: stan czynnościowy bywa odwracalny, a granice między podtypami nie są w komórkach ludzkich ostre.

Odwracalność stanu czynnościowego nosi nazwę plastyczności i została zmierzona w modelach zwierzęcych metodą trwałego znakowania komórek. W myszach z takim znacznikiem przewlekłe zapalenie mózgu i rdzenia wygaszało w komórkach Th17 wytwarzanie interleukiny 17 i uruchamiało wytwarzanie interferonu gamma [27]. W rdzeniu kręgowym niemal cały interferon gamma pochodził z komórek, które wcześniej wytwarzały interleukinę 17 i zostały przekierowane przez interleukinę 23 [27]. Przy ostrym zakażeniu skóry drożdżakiem Candida albicans takiej zmiany zestawu cytokin nie stwierdzono, choć wytwarzanie interleukiny 17 w toku zakażenia zostało wyłączone [27]. Plastyczność zależy zatem od rodzaju zapalenia, a nie od samego pobudzenia komórki.

Niestabilny bywa również stan limfocytów regulatorowych. U myszy część komórek wykazywała przejściową obecność czynnika FOXP3, a komórki, które go utraciły, miały cechy limfocytów pamięci i wytwarzały cytokiny prozapalne [28]. Komórek tych było więcej w tkankach objętych zapaleniem [28]. Przeniesienie ich frakcji rozpoznającej antygeny własne wywoływało u myszy z predyspozycją do cukrzycy szybki początek choroby [28]. Odpowiednika tego zjawiska u ludzi nie zmierzono w ten sposób, bo trwałe znakowanie komórek jest w badaniu człowieka niewykonalne. Pojęcie linii komórkowej zastąpiono więc w piśmiennictwie ostatnich lat pojęciem stanu utrwalonego w różnym stopniu [29].

Granice podziału zacierają się najbardziej w obrębie komórek wytwarzających interleukinę 17. Okazały się one rodziną stanów o różnym składzie cytokin i różnym udziale w zapaleniu tkanek [30]. W stwardnieniu rozsianym opisano wśród nich populację Th17.1, noszącą receptory CCR6 i CXCR3 bez receptora CCR4 [31]. Komórki te wytwarzają interferon gamma i GM-CSF, a gromadzą się w płynie mózgowo-rdzeniowym chorych na wczesnym etapie choroby [31]. Cztery nazwy podtypów opisują więc punkty w przestrzeni fenotypów, a nie cztery zamknięte zbiory komórek.

Przenoszenie nazw między gatunkami jest osobnym źródłem nieporozumień. Różnice między odpornością myszy i człowieka obejmują wprost różnicowanie w stronę Th1 i Th2, a także skład podzbiorów leukocytów i repertuar receptorów [32]. Czynniki wymagane do polaryzacji komórek ludzkich w stronę interleukiny 17 różnią się od czynników opisanych u myszy [26]. Zespół Acosta-Rodriguez podał tę rozbieżność jako ważną różnicę międzygatunkową [26], a późniejsza praca w hodowli bez surowicy wykazała, że także komórki ludzkie potrzebują transformującego czynnika wzrostu beta [64]. Wynik uzyskany na myszach wskazuje zatem mechanizm możliwy, nie mechanizm potwierdzony u człowieka.

Limfocyty T regulatorowe zajmują w tym zestawie miejsce osobne, bo ich zadaniem jest hamowanie odpowiedzi, a nie jej prowadzenie. Powstają dwiema drogami, w grasicy i na obwodzie, a repertuar rozpoznawanych antygenów obejmuje w większym stopniu białka własne [4]. Hamowanie opiera się u nich na kilku niezależnych mechanizmach naraz, między innymi na przechwytywaniu interleukiny 2 przez cząsteczkę CD25 i na wydzielaniu interleukiny 10 [4]. Tym samym ta sama komórka, która w innych podtypach oznacza początek odpowiedzi, w tym podtypie oznacza jej granicę.

Poza czterema stanami głównymi opisano kilka węższych fenotypów. Pomocnicze limfocyty grudkowe Tfh mają jako czynnik główny białko Bcl6. Jego obecność w limfocytach CD4 myszy była zarówno potrzebna, jak i wystarczająca do powstania tych komórek oraz do udzielenia pomocy limfocytom B w grudce chłonnej [33]. Limfocyty Th9 powstają, gdy transformujący czynnik wzrostu beta działa na komórki Th2 razem z interleukiną 4, a ich cechą jest wydzielanie interleukiny 9 w modelu mysim [34]. Limfocyty Th22 opisano u człowieka jako komórki z receptorami CCR6, CCR4 i CCR10 [35]. Wytwarzają one interleukinę 22 bez interleukiny 17, a ich fenotyp zależy od receptora węglowodorów aromatycznych [35]. Lista stanów czynnościowych pozostaje więc otwarta i rośnie razem z rozdzielczością metod pomiaru [30].

2.4. Funkcje

Funkcje limfocytów pomocniczych dzielą się według rodzaju zagrożenia, z jakim komórka wykonawcza nie radzi sobie bez pomocy. Każdemu rodzajowi zagrożenia odpowiada inny stan czynnościowy i inna komórka będąca odbiorcą cytokin.

2.4.1. Obrona przed drobnoustrojami wewnątrz komórek

Limfocyty Th1 odpowiadają za usuwanie drobnoustrojów, które przeżywają wewnątrz komórek żernych i są tam niedostępne dla przeciwciał. Stanem wyjściowym jest makrofag, który pochłonął prątki lub pierwotniaki, lecz nie zabija ich skutecznie. Bodźcem dla limfocytu jest interleukina 12 wydzielana przez ten makrofag po kontakcie z bakterią, co zmierzono na makrofagach myszy zetkniętych z bakterią Listeria monocytogenes [15]. Interleukina 12 działa przez białko STAT4, włącza czynnik T-bet i uruchamia wytwarzanie interferonu gamma [1, 9]. Interferon gamma wraca do makrofaga i zwiększa jego zdolność zabijania pochłoniętych drobnoustrojów oraz nasila przedstawianie antygenów [2].

Powstaje w ten sposób pętla, w której komórka żerna i limfocyt wzmacniają się wzajemnie, dopóki drobnoustrój nie zostanie usunięty. Swoistość tej odpowiedzi widać w repertuarze antygenów. Ludzkie limfocyty pamięci rozpoznające Mycobacterium tuberculosis mieściły się we frakcji z receptorami CCR6 i CXCR3, czyli w populacji wytwarzającej interferon gamma [8]. Skutkiem sprawnej pętli jest opanowanie zakażenia bez rozległego uszkodzenia tkanki, a skutkiem jej przerwania jest namnażanie drobnoustroju w makrofagach mimo prawidłowej liczby komórek żernych.

2.4.2. Obrona przed pasożytami i naprawa bariery jelit

Limfocyty Th2 odpowiadają za obronę przed pasożytami wielokomórkowymi i za odbudowę uszkodzonej bariery nabłonkowej. Pasożyt jelitowy jest zbyt duży, by komórka żerna go pochłonęła, więc obrona polega na zmianie właściwości tkanki, a nie na zabiciu intruza. Interleukina 13 pobudza komórki kubkowe nabłonka do wydzielania śluzu i zwiększa skurcze mięśni gładkich [1]. Interleukina 5 ściąga i utrzymuje granulocyty kwasochłonne, a interleukina 4 przestawia limfocyty B na wytwarzanie przeciwciał klasy IgE [1]. Suma tych zmian utrudnia pasożytowi przyczepienie się do ściany jelita i przyspiesza jego usunięcie ze światła przewodu pokarmowego.

Sygnałem początkowym nie musi być przy tym antygen. Uszkodzenie nabłonka uwalnia interleukinę 33, która działa przez receptor ST2 na limfocytach Th2 i na mastocytach, więc uraz bariery sam uruchamia odpowiedź typu drugiego [24]. W modelach mysich zakażenia robakami jelitowymi limfocyty Th2 współpracują z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi grupy drugiej [36]. Komórki te wydzielają te same cytokiny, lecz odpowiadają wcześniej i bez rozpoznania antygenu, a udział obu populacji rozkłada się na różne etapy zakażenia [36]. Ta sama odpowiedź, uruchomiona wobec nieszkodliwego białka środowiskowego, staje się podstawą alergii [24].

2.4.3. Obrona błon śluzowych przed grzybami i bakteriami zewnątrzkomórkowymi

Limfocyty Th17 utrzymują szczelność błon śluzowych i skóry wobec grzybów oraz bakterii mnożących się poza komórkami. Komórki te przebywają na stałe w blaszce właściwej jelita, czyli w miejscu ciągłego kontaktu z drobnoustrojami [11]. Interleukiny 17A i 17F działają na nabłonek i fibroblasty, a te w odpowiedzi wydzielają chemokiny ściągające granulocyty obojętnochłonne oraz peptydy przeciwbakteryjne. Interleukina 22 działa na sam nabłonek, przyspieszając odnowę komórek i wzmacniając połączenia między nimi [18].

Znaczenie tej drogi u człowieka rozstrzygnęły wrodzone defekty jej elementów. U osób z brakiem czynnego receptora interleukiny 17 oraz u osób z częściowym niedoborem interleukiny 17F stwierdzono przewlekłą drożdżycę skóry i błon śluzowych, a rzadziej zakażenia skóry gronkowcem złocistym [37]. Innych zakażeń ani objawów autoimmunizacji u tych chorych nie opisano [37]. Interleukiny 17A i 17F są zatem konieczne do obrony błon śluzowych przed Candida albicans, a w pozostałych obszarach obrony dają się zastąpić innymi mechanizmami [37]. Zgodnie z tym ludzkie limfocyty pamięci rozpoznające Candida albicans skupiały się we frakcji z receptorami CCR6 i CCR4, czyli w populacji wytwarzającej interleukinę 17 [8].

2.4.4. Utrzymanie tolerancji wobec antygenów własnych

Limfocyty regulatorowe odpowiadają za to, że odpowiedź nie rozwija się przeciw białkom własnym i że po usunięciu drobnoustroju wygasa. Selekcja w grasicy usuwa większość komórek rozpoznających antygeny własne, lecz nie wszystkie [14]. Część białek narządowych w ogóle nie trafia do repertuaru sprawdzanego w tym narządzie [14]. Limfocyty regulatorowe stanowią wobec tego drugie zabezpieczenie, działające w tkankach przez całe życie.

Siłę tego zabezpieczenia pokazało doświadczenie z usunięciem frakcji komórek. Po przeniesieniu limfocytów CD4 myszy pozbawionych komórek z cząsteczką CD25 do myszy bezgrasiczych u wszystkich zwierząt rozwinęły się choroby o podłożu autoimmunologicznym [19]. Wśród nich opisano zapalenie tarczycy, zapalenie żołądka, zapalenie wysp trzustkowych i zapalenie stawów [19]. Uzupełnienie brakującej frakcji w krótkim czasie po przeniesieniu zapobiegało tym chorobom, a uzupełnienie po kilku dniach było już znacznie mniej skuteczne [19]. Hamowanie działa zatem na etapie pobudzania limfocytu, nie na etapie uszkodzenia narządu.

Drugim zadaniem tych komórek jest ograniczanie rozmiaru odpowiedzi prawidłowej. Nadmiar odpowiedzi przeciw drobnoustrojowi uszkadza tkankę tak samo jak sam drobnoustrój, a komórki hamujące wyznaczają granicę, przy której odpowiedź się zatrzymuje [4]. Konsekwencją ich niedoboru jest zapalenie wielonarządowe, a konsekwencją ich nadmiernej aktywności w guzie jest osłabienie odpowiedzi przeciwnowotworowej [4].

2.4.5. Pomoc w wytwarzaniu przeciwciał

Limfocyty pomocnicze umożliwiają powstanie przeciwciał o dużym powinowactwie do antygenu. Limfocyt B, który rozpoznał antygen sam, wytwarza przeciwciała klasy IgM o powinowactwie niewielkim i nie tworzy pamięci. Zmiana klasy przeciwciała i dopasowanie jego powinowactwa wymagają kontaktu z limfocytem pomocniczym w grudce chłonnej [5].

Pomoc tę pełnią przede wszystkim pomocnicze limfocyty grudkowe Tfh, których czynnikiem głównym jest białko Bcl6. W limfocytach CD4 myszy obecność tego białka była zarówno konieczna, jak i wystarczająca do powstania komórek Tfh i do udzielenia pomocy limfocytom B w grudce chłonnej [33]. Przeciwstawny czynnik Blimp-1 pomoc tę znosił i blokował powstawanie grudek wtórnych [33]. Wydzielana przez te komórki interleukina 21 pobudza podziały limfocytów B oraz ich przejście w komórki wydzielające przeciwciała [5]. Klasa powstających przeciwciał zależy przy tym od zestawu cytokin. Interleukina 4 kieruje limfocyt B w stronę przeciwciał klasy IgE, a interferon gamma w stronę innych podklas IgG [1]. Skutkiem tej pomocy jest przeciwciało dopasowane do antygenu i pamięć utrzymująca się po zakończeniu zakażenia [5]. Brakiem tej pomocy tłumaczy się słabe odpowiedzi humoralne przy niedoborach limfocytów pomocniczych [5].

2.5. Interakcje z innymi komórkami

Limfocyt pomocniczy pracuje wyłącznie w układzie z innymi komórkami, bo sam nie usuwa ani drobnoustroju, ani uszkodzonej tkanki. Kierunek tych zależności jest dwustronny: komórka prezentująca antygen narzuca limfocytowi stan czynnościowy, a limfocyt zmienia potem zachowanie komórek wykonawczych w tkance.

Pierwszym partnerem jest komórka dendrytyczna albo monocyt, które przedstawiają antygen i równocześnie wydzielają cytokiny rozstrzygające o polaryzacji. W komórkach ludzkich zdolność do wzbudzania odpowiedzi z interleukiną 17 odpowiadała wytwarzaniu interleukin 1β i 6 przez komórki prezentujące antygen [26]. Wytwarzaniu interleukiny 12 nie odpowiadała [26]. Skład sygnałów pochodzi więc od komórki, która pierwsza zetknęła się z drobnoustrojem, a limfocyt tylko ten skład odczytuje.

Drugim partnerem są komórki żerne. Makrofag pobudzony interferonem gamma zabija pochłonięte drobnoustroje skuteczniej i silniej przedstawia antygeny, a sam wcześniej dostarczył limfocytowi interleukinę 12 [15]. Trzecim partnerem są komórki nabłonka i fibroblasty, na które działają interleukiny 17 i 22. Nabłonek pobudzony tymi cytokinami wydziela chemokiny ściągające granulocyty obojętnochłonne, więc limfocyt Th17 kieruje do tkanki komórki, na które sam nie działa bezpośrednio [18].

Czwartą grupę tworzą komórki odpowiedzi typu drugiego, czyli granulocyty kwasochłonne i mastocyty [24]. Utrzymuje je w tkance interleukina 5, a pobudza interleukina 33, działająca też na limfocyty Th2 [24]. Piątym partnerem są limfocyty B w grudkach chłonnych [33]. Osobne miejsce zajmują wrodzone komórki limfoidalne, które wydzielają te same cytokiny co podtypy pomocnicze [3]. Reagują one na sygnały tkankowe i nie mają przebudowanego receptora antygenowego [3]. Odpowiedź w tkance jest zatem sumą działania komórek swoistych i nieswoistych, a przypisanie całego skutku samym limfocytom pomocniczym zawyża ich udział [3, 36].

3. Dysfunkcja i choroby

3.1. Nadmierna aktywacja i przeciążenie

Ten sam mechanizm, który usuwa drobnoustroje, uszkadza tkankę, gdy zostanie uruchomiony wobec antygenu nieszkodliwego albo wobec białka własnego. Nadmierna aktywacja limfocytów pomocniczych nie polega na wytwarzaniu innych cytokin niż w obronie prawidłowej. Polega ona na ich wytwarzaniu w niewłaściwym miejscu, wobec niewłaściwego antygenu i przez czas zbyt długi. Kierunek szkody zależy od podtypu, który przeważył.

Przewaga odpowiedzi typu drugiego wobec białek środowiskowych daje obraz chorób alergicznych. Interleukina 4 kieruje limfocyty B na wytwarzanie przeciwciał klasy IgE przeciw pyłkowi albo białku pokarmowemu [1]. Interleukina 5 utrzymuje w tkance granulocyty kwasochłonne, a interleukina 13 nasila wydzielanie śluzu i reaktywność mięśni gładkich oskrzeli [1]. Interleukina 33, uwalniana z uszkodzonego nabłonka, podtrzymuje ten stan niezależnie od ilości antygenu [24]. Uczestniczy ona także w zapaleniu stawów, w zapaleniu skóry oraz w reakcji anafilaktycznej, pobudzając mastocyty [24].

Przewaga odpowiedzi z interleukiną 17 daje obraz przewlekłego zapalenia z naciekiem granulocytów obojętnochłonnych. W płynie stawowym chorych na reumatoidalne zapalenie stawów odsetek komórek wytwarzających interleukinę 17 był większy niż we krwi tych samych chorych i niż we krwi osób zdrowych [38]. Stężenie interleukiny 17 w błonie maziowej przekraczało wartości z tkanki osób zdrowych i chorych na chorobę zwyrodnieniową stawów [38]. Interleukinę 23 wykrywano w płynie stawowym rzadko, choć makrofagi z tego płynu miały więcej jej informacyjnego RNA niż makrofagi kontrolne [38]. Autorzy uznali więc udział limfocytów Th17 w chorobie za prawdopodobny, a rolę interleukiny 23 w ich powstawaniu w stawie za słabo udokumentowaną [38].

Osobnym mechanizmem przeciążenia jest przewlekłe pobudzenie zmieniające stan czynnościowy komórki. W modelu zapalenia mózgu i rdzenia u myszy przewlekła obecność interleukiny 23 przekierowała komórki Th17 na wytwarzanie interferonu gamma i innych cytokin prozapalnych [27]. Interleukina 23, a nie interleukina 12, była w tym modelu czynnikiem krytycznym dla zapalenia mózgu [21]. Zapalenie utrwalone różni się zatem od zapalenia ostrego nie tylko czasem trwania, lecz także składem cytokin wydzielanych przez te same komórki.

Kontrola tego nadmiaru zależy od komórek hamujących, których działanie słabnie właśnie w zapaleniu. Interleukina 6 obecna w tkance zapalnej blokuje powstawanie komórek FOXP3-dodatnich z limfocytów obojętnych i kieruje je w stronę wytwarzania interleukiny 17 [25]. Stan zapalny sam więc osłabia własny hamulec, co tłumaczy skłonność takich zapaleń do przechodzenia w postać przewlekłą.

3.2. Utrata funkcji i ubytek

Ubytek limfocytów pomocniczych albo utrata jednej z ich funkcji odsłania zakres, w jakim pozostałe komórki odpornościowe od nich zależą. Obraz kliniczny zależy przy tym od tego, czy brakuje całej populacji CD4, czy tylko jednego stanu czynnościowego.

Zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności prowadzi do ubytku limfocytów CD4. Największe zmniejszenie ich liczby dotyczy tkanki przewodu pokarmowego, a nie krwi, i obejmuje przede wszystkim komórki noszące receptor CCR5 [39]. Skutkiem immunologicznym jest utrata pomocy dla makrofagów i dla limfocytów B. Pojawiają się przez to zakażenia drobnoustrojami, które u osób z prawidłową liczbą tych komórek chorób nie wywołują.

Wrodzony brak czynnika FOXP3 pokazuje skutki utraty samej funkcji hamującej. Mutacje genu FOXP3 wywołują zespół IPEX, dziedziczony w sposób sprzężony z chromosomem X [20]. Nazwa zespołu obejmuje zaburzenie regulacji odporności, poliendokrynopatię i enteropatię [20]. U chorych z tym zespołem rozwijają się w pierwszych miesiącach życia ciężka enteropatia, cukrzyca i zapalenie skóry [20]. Przyczyną jest brak czynnych limfocytów regulatorowych przy prawidłowej liczbie pozostałych limfocytów [12, 20]. Wynik ten odpowiada doświadczeniu z usunięciem frakcji komórek z cząsteczką CD25 u myszy [19].

Utrata jednego stanu czynnościowego ma węższe następstwa. W zespole hiper-IgE dziedziczonym autosomalnie dominująco, wywołanym mutacjami genu STAT3, limfocyty chorych po pobudzeniu nie wytwarzały interleukiny 17 [40]. Wytwarzanie interleukiny 2, interferonu gamma i czynnika martwicy nowotworów pozostawało u nich zachowane [40]. Limfocyty obojętne tych chorych nie różnicowały się w warunkach doświadczalnych w komórki wytwarzające interleukinę 17 i miały mniej czynnika RORγt [40]. Obraz kliniczny obejmuje nawracające zapalenia płuc, ropnie gronkowcowe skóry oraz drożdżycę błon śluzowych, czyli zakażenia tymi drobnoustrojami, wobec których interleukina 17 jest konieczna [40]. Węższy wariant tej zależności stanowią defekty samego receptora interleukiny 17 i interleukiny 17F [37]. Obraz kliniczny ogranicza się przy nich do przewlekłej drożdżycy skóry i błon śluzowych oraz, rzadziej, zakażeń gronkowcowych skóry [37].

Osobną postacią utraty funkcji jest zamiana komórki hamującej w komórkę prozapalną. U myszy komórki, które utraciły czynnik FOXP3, gromadziły się w tkankach objętych zapaleniem i wytwarzały cytokiny prozapalne [28]. Ich frakcja rozpoznająca antygeny własne wywoływała po przeniesieniu szybki początek cukrzycy [28]. Sam pomiar liczby komórek FOXP3-dodatnich nie rozstrzyga więc o sile hamowania w tkance.

3.3. Udział w chorobach

Udział limfocytów pomocniczych w chorobie oznacza, że ich cytokiny podtrzymują zmiany w tkance, a nie tylko towarzyszą im jako znacznik zapalenia. Dowody tego udziału są w poszczególnych chorobach różnej mocy. Najsłabszym z nich jest obecność komórek w zmienionej tkance, mocniejszym związek z aktywnością choroby, a najmocniejszym ustąpienie zmian po zablokowaniu jednej cytokiny.

Najsilniejsze dowody zebrano dla łuszczycy. Interleukina 17 wydzielana w skórze pobudza keratynocyty do podziałów i do wytwarzania chemokin, a powstająca w ten sposób pętla utrzymuje blaszkę łuszczycową [41]. Oś złożona z interleukiny 23 i interleukiny 17 uczestniczy również w łuszczycowym zapaleniu stawów i w spondyloartropatiach osiowych [42]. Interleukinę 23 wytwarzają w niej komórki prezentujące antygen, a interleukinę 17 limfocyty Th17 [42]. W chorobach stawów kręgosłupa interleukiny 17 i 22 wiążą się z niszczeniem kości oraz z tworzeniem kości nowej [42].

W reumatoidalnym zapaleniu stawów komórki wytwarzające interleukinę 17 gromadzą się w płynie stawowym [38]. W błonie maziowej chorych stwierdza się większe stężenie tej cytokiny niż w tkance osób zdrowych [38]. W tej chorobie znaczenie ma jednak także czynnik martwicy nowotworów, a udział poszczególnych cytokin różni się między chorymi [41]. W nieswoistych zapaleniach jelit oś interleukin 23 i 17 uczestniczy w utrzymaniu nacieku w ścianie jelita [41]. Komórki wytwarzające interleukinę 17 pełnią w błonie śluzowej jelita również zadania ochronne, więc ich rola nie jest w tej tkance jednoznaczna [30].

W stwardnieniu rozsianym udział tych komórek wskazano najpierw w modelu doświadczalnym, gdzie czynnikiem krytycznym dla zapalenia mózgu okazała się interleukina 23 [21]. U ludzi z zespołem klinicznie izolowanym mała liczba komórek Th17.1 we krwi wiązała się z szybkim rozpoznaniem postaci definitywnej choroby [31]. Komórki te gromadziły się w płynie mózgowo-rdzeniowym i wytwarzały tam interferon gamma oraz GM-CSF [31]. Rozkład tych komórek między krwią a płynem mózgowo-rdzeniowym odpowiada więc ich przechodzeniu do ośrodkowego układu nerwowego, a nie ich zanikaniu.

W chorobach z uszkodzeniem narządów przez odpowiedź przeciw własnym białkom, takich jak cukrzyca typu 1, udział limfocytów pomocniczych obejmuje obie strony równowagi. Komórki rozpoznające antygeny wysp trzustkowych prowadzą odpowiedź, a komórki regulatorowe jej nie zatrzymują [4]. Opisywane u chorych zaburzenie dotyczy raczej czynności komórek hamujących niż ich liczby [4]. Choroby alergiczne stanowią po drugiej stronie przykład udziału odpowiedzi typu drugiego, uruchomionej wobec antygenu nieszkodliwego [24]. Wspólnym mianownikiem tych obrazów jest przesunięcie równowagi między podtypami, nie samo pojawienie się jednego z nich.

3.4. Punkt uchwytu leków

Limfocyt pomocniczy nie jest celem leków bezpośrednio, bo dostępne przeciwciała monoklonalne wiążą jego cytokiny albo receptory tych cytokin. Blokada jednej cytokiny sprawdza przy tym hipotezę o jej udziale w chorobie. Wyniki takich badań rozstrzygają zatem o mechanizmie, a nie tylko o skuteczności leku. Wynik negatywny rozstrzyga w tym obszarze tyle samo co wynik dodatni.

Przeciwciała przeciw interleukinie 17A dały w łuszczycy efekt duży. W badaniu ERASURE wzięło udział 738 chorych na łuszczycę plackowatą [43]. Zmniejszenie wskaźnika PASI o co najmniej 75 procent po 12 tygodniach uzyskało 81,6 oraz 71,6 procent chorych w dwóch grupach otrzymujących sekukinumab i 4,5 procent chorych w grupie placebo [43]. Metaanaliza sieciowa objęła 179 badań z randomizacją i 62 339 uczestników [44]. Leki przeciw interleukinie 17 osiągnęły w niej jako klasa najwyższy odsetek chorych ze zmniejszeniem wskaźnika PASI o co najmniej 90 procent [44]. Skuteczność tej blokady potwierdza udział interleukiny 17 w utrzymaniu blaszki łuszczycowej.

Ta sama blokada w chorobie Leśniowskiego-Crohna zawiodła. W badaniu z randomizacją u 59 chorych oszacowano na mniej niż 0,1 procent prawdopodobieństwo, że sekukinumab zmniejszy wskaźnik aktywności choroby o co najmniej 50 punktów bardziej niż placebo [45]. Analiza dodatkowa z okresu od 4. do 10. tygodnia wypadła na korzyść placebo [45]. W grupie otrzymującej lek stwierdzono 20 zakażeń, w tym cztery miejscowe zakażenia grzybicze [45]. W grupie placebo nie stwierdzono żadnego [45]. Wynik ten zgadza się z ochronną rolą interleukiny 17 w błonie śluzowej jelita. Blokada jednej cytokiny nie daje zatem tego samego skutku w dwóch narządach.

Blokada wyżej położonej interleukiny 23 zadziałała w tej chorobie inaczej. Rysankizumab jest przeciwciałem przeciw podjednostce p19 interleukiny 23. W badaniu podtrzymującym FORTIFY dał on po 52 tygodniach odpowiedź endoskopową u 47 procent chorych wobec 22 procent w grupie odstawienia leku [46]. Ustekinumab wiąże wspólną podjednostkę p40 interleukin 12 i 23. U 249 chorych na postać rzutowo-remisyjną stwardnienia rozsianego nie zmniejszył on liczby nowych ognisk wzmacniających się po podaniu gadolinu [47]. Udział osi interleukin 23 i 17 jest zatem dobrze udokumentowany w skórze i w jelicie. W ośrodkowym układzie nerwowym pozostaje on niepotwierdzony w badaniu z randomizacją.

Odpowiedź typu drugiego blokują dwa inne leki. Dupilumab wiąże łańcuch alfa receptora interleukiny 4 i wyłącza w ten sposób sygnał interleukin 4 oraz 13 [48]. W badaniu u 1902 chorych na astmę niekontrolowaną zmniejszył roczną częstość ciężkich zaostrzeń o 47,7 procent wobec placebo [48]. Mepolizumab wiąże interleukinę 5, czyli cytokinę utrzymującą granulocyty kwasochłonne [49]. U 576 chorych na ciężką astmę eozynofilową zmniejszył częstość zaostrzeń o 47 procent przy podaniu dożylnym oraz o 53 procent przy podaniu podskórnym [49].

Osobną drogą jest wzmacnianie hamowania zamiast blokowania cytokin. W badaniu pierwszej fazy u 14 dorosłych z cukrzycą typu 1 podano namnożone poza organizmem własne limfocyty regulatorowe [50]. Po roku utrzymywało się we krwi do 25 procent szczytowej liczby przeniesionych komórek, bez reakcji poinfuzyjnych i bez zdarzeń niepożądanych wysokiego stopnia [50]. Badania wczesnych faz wykazały wykonalność i tolerancję takiego postępowania, a skuteczności nie rozstrzygnęły [51]. Komórki regulatorowe z wprowadzonym receptorem chimerycznym, czyli receptorem skierowanym na wybrany antygen, są w tym obszarze przedmiotem prac wczesnego etapu [52].

3.5. Wsparcie suplementacyjne

Wpływ składników odżywczych na limfocyty pomocnicze mierzy się w badaniach u ludzi jako zmianę odsetka komórek Th17 i regulatorowych we krwi obwodowej. Rzadziej mierzy się go jako zmianę wytwarzania cytokin. Punktem uchwytu jest w tych pracach różnicowanie komórek, a nie objaw choroby. Substancje wymienione niżej mają dane z badań u ludzi albo z modeli zwierzęcych. Żadna z nich nie ma metaanalizy badań z randomizacją z takim punktem końcowym.

Siła dowodu jest zatem w tym zestawieniu ograniczona po obu stronach. Badania u ludzi obejmowały grupy kilkudziesięcioosobowe i krótkie okresy obserwacji, a wynik dotyczący kwasu masłowego pochodzi z modelu mysiego i u ludzi nie został potwierdzony. Punktem końcowym był w nich głównie odsetek komórek w krwi obwodowej, a autorzy przeglądu systematycznego uznali, że wpływ na liczbę i czynność komórek regulatorowych wymaga badań o odpowiedniej mocy [54].

4. Na co warto zwrócić uwagę

Podział na dwa przeciwstawne kierunki odpowiedzi, Th1 i Th2, bywa przedstawiany jako waga o dwóch szalkach, na której przewaga jednej strony wyjaśnia chorobę. Taki obraz odpowiada stanowi wiedzy z końca lat osiemdziesiątych. Po wyodrębnieniu komórek wytwarzających interleukinę 17 i komórek regulatorowych kierunków jest co najmniej cztery [1]. Po uwzględnieniu plastyczności i fenotypów mieszanych granice między nimi przestają być ostre [29, 30]. Określenia w rodzaju „dominacja Th1” albo „przewaga Th2” nie mają odpowiednika w rozpoznaniu klinicznym i nie wynikają z żadnego oznaczenia wykonywanego w laboratorium diagnostycznym.

Podtypów limfocytów pomocniczych nie oznacza się bowiem rutynowo. Ich rozpoznanie wymaga cytometrii przepływowej z wykrywaniem cytokin wewnątrz komórki po sztucznym pobudzeniu materiału. Wynik zależy od sposobu pobudzenia, od zestawu przeciwciał i od pracowni. Zakresy podawane w piśmiennictwie pochodzą z pojedynczych grup. Wartości podane dla limfocytów Th1 zmierzono u 150 osób jednej narodowości w jednej prowincji, a rozpiętość ich zakresu przekraczała w tej grupie stukrotność [17]. Pojedynczy wynik odsetkowy nie ma zatem ustalonego znaczenia klinicznego.

Rutynowo mierzy się natomiast całą pulę limfocytów CD4, bez podziału na stany czynnościowe. Liczba tych komórek i ich odsetek weszły w 1993 roku do definicji nadzoru nad zespołem nabytego niedoboru odporności [61]. Próg wyznaczono poniżej 200 komórek na mikrolitr albo poniżej 14 procent limfocytów [61]. Osobnym wskaźnikiem jest stosunek limfocytów CD4 do CD8. U części osób zakażonych wirusem HIV pozostaje on niski mimo skutecznego leczenia przeciwretrowirusowego i mimo powrotu liczby limfocytów CD4 powyżej 500 komórek na mikrolitr. Niski stosunek wiązał się w czterech badanych grupach z większym pobudzeniem limfocytów CD8 i z ich fenotypem starzenia [62]. Wiązał się też z większym ryzykiem chorób niezwiązanych z zespołem nabytego niedoboru odporności oraz z większym ryzykiem zgonu [62]. Wskaźniki te opisują liczebność całej populacji pomocniczej, a nie równowagę między jej podtypami.

Wnioski o wzmacnianiu odporności przez pojedynczą substancję nie mają w tym obszarze podstawy pomiarowej. Analiza objęła 227 stron internetowych z okresu pandemii choroby COVID-19 [63]. Pojęcie wzmacniania odporności przedstawiono jako korzystne na 85,5 procent tych stron, a krytycznie odniosło się do niego mniej niż 10 procent [63]. Przegląd systematyczny badań z witaminą D nie pozwolił z powodu różnorodności prac na metaanalizę, a skuteczności zwiększania liczby komórek regulatorowych w leczeniu chorób autoimmunologicznych nie uznano w nim za ustaloną [54]. Zmiana odsetka tych komórek we krwi jest więc wskaźnikiem pośrednim, a nie odpowiednikiem poprawy odporności ani zahamowania choroby.

Ostrożności wymaga też przenoszenie wniosków między tkankami i między gatunkami. Blokada interleukiny 17 usuwa zmiany skórne w łuszczycy [43]. W chorobie Leśniowskiego-Crohna wypadła ona gorzej od placebo i wiązała się z większą liczbą zakażeń, bo ta sama cytokina utrzymuje szczelność błony śluzowej jelita [45]. Różnice między odpornością myszy i człowieka obejmują wprost różnicowanie limfocytów pomocniczych [32]. Czynniki polaryzujące komórki ludzkie w stronę interleukiny 17 opisano początkowo jako odmienne od mysich [26], a rozbieżność tę w dużej części wyjaśniła zmiana warunków hodowli [64]. Rozpoznanie choroby o podłożu immunologicznym i wybór leczenia pozostają w rękach lekarza, bo opierają się na obrazie klinicznym, a nie na oznaczeniu podtypów limfocytów.