Enzymy antyoksydacyjne

1. Charakterystyka enzymów antyoksydacyjnych

1.1. Definicja i zakres

Enzymy antyoksydacyjne (ang. antioxidant enzymes) to białka katalityczne należące do oksydoreduktaz, które przekształcają anionorodnik ponadtlenkowy i nadtlenki w cząsteczki mniej reaktywne. Anionorodnik ponadtlenkowy powstaje, gdy cząsteczka tlenu przyjmie jeden elektron, a nadtlenek wodoru, gdy przyjmie dwa. Do tej samej klasy należą enzymy, które odtwarzają zredukowaną postać białek i peptydów bezpośrednio usuwających te utleniacze. Kryterium przynależności jest więc funkcjonalne: enzym albo sam rozkłada utleniacz, albo przywraca tę zdolność innemu składnikowi układu. Dysmutazy ponadtlenkowe noszą numer EC 1.15.1.1, czyli numer nadawany przez Komisję Enzymatyczną według typu katalizowanej reakcji [1].

Enzymy antyoksydacyjne różnią się od antyoksydantów niskocząsteczkowych, takich jak witamina C, witamina E czy glutation, sposobem działania. Cząsteczka antyoksydantu reaguje z utleniaczem w stałej proporcji i sama przy tym ulega utlenieniu. Enzym natomiast wraca po każdym cyklu katalitycznym do stanu wyjściowego, więc jedna jego cząsteczka przetwarza wiele cząsteczek utleniacza. Glutation jest przy tym substratem części enzymów tej klasy, a nie jej członkiem. Kryterium różnicującym jest zatem katalityczny, a nie stechiometryczny charakter reakcji.

Zakres klasy obejmuje dwie grupy białek. Pierwszą tworzą enzymy reagujące bezpośrednio z utleniaczem: dysmutazy ponadtlenkowe, katalaza, peroksydazy glutationowe i peroksyredoksyny. Drugą tworzą układy odtwarzające, czyli reduktaza glutationowa oraz tioredoksyna z reduktazą tioredoksyny [2]. Przenoszą one elektrony z NADPH, czyli zredukowanego fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego, który w komórce jest głównym dawcą elektronów dla reakcji redukcji [2]. Hemoksygenaza nie wchodzi do klasy, bo rozkłada hem, a przeciwutleniająco działają dopiero jej produkty.

Wspólny opis tych enzymów wyjaśnia zjawiska, których nie tłumaczy żaden z nich osobno. Należą do nich podział pracy między przedziałami komórki i zależność od kilku pierwiastków śladowych jednocześnie. Wspólny opis wyjaśnia też, dlaczego te same białka chronią przed uszkodzeniem i regulują przekazywanie sygnałów przez nadtlenek wodoru [3, 4].

1.2. Podział i kryteria klasyfikacji

Enzymy antyoksydacyjne dzieli się według pięciu kryteriów, które odpowiadają na różne pytania o ich działanie. Pierwsze kryterium to substrat. Dysmutazy ponadtlenkowe przyjmują anionorodnik ponadtlenkowy, a katalazy i peroksydazy przyjmują nadtlenek wodoru oraz nadtlenki organiczne. Pierwsza grupa działa zatem na wcześniejszym etapie redukcji tlenu, a druga na etapie późniejszym.

Drugie kryterium to chemia centrum aktywnego. W dysmutazach i katalazie elektron przenosi jon metalu zmieniający stopień utlenienia. W peroksydazach tiolowych robi to atom siarki reszty cysteiny albo atom selenu reszty selenocysteiny [5, 6]. Od tego kryterium zależy, którego pierwiastka śladowego enzym potrzebuje.

Trzecie kryterium to potrzeba zewnętrznego reduktora. Katalaza rozkłada nadtlenek wodoru do wody i tlenu bez udziału innej cząsteczki. Peroksydazy glutationowe potrzebują glutationu, a peroksyredoksyny tioredoksyny [2, 6]. Z tego kryterium wynika podział na peroksydazy glutationowe i peroksyredoksyny w obrębie peroksydaz tiolowych.

Czwarte kryterium to przedział, w którym enzym działa: cytozol, mitochondria, peroksysomy albo przestrzeń pozakomórkowa [1]. Piąte kryterium to funkcja w układzie. Enzymy pierwszej linii rozkładają utleniacze, a reduktazy disiarczkowe zależne od NADPH odtwarzają ich zredukowaną postać [2]. Zestawienie kryteriów daje cztery grupy: dysmutazy ponadtlenkowe, katalazy, peroksydazy tiolowe i reduktazy disiarczkowe.

1.3. Różnice z podobnymi klasami białek

Enzymy antyoksydacyjne graniczą z trzema klasami białek, które także wpływają na poziom utleniaczy w komórce. Pierwszą są enzymy II fazy biotransformacji, zwłaszcza transferazy S-glutationowe. Zużywają one glutation podobnie jak peroksydazy, ale przyłączają go do cząsteczek elektrofilowych, co ułatwia ich wydalenie. Produktem ich reakcji jest koniugat, a nie woda, więc kryterium rozkładu utleniacza nie jest spełnione.

Drugą klasą są białka wiążące metale przejściowe, takie jak ferrytyna i ceruloplazmina. Zmniejszają one dostępność wolnego żelaza i miedzi, a przez to ograniczają powstawanie rodnika hydroksylowego. Same jednak nie rozkładają anionorodnika ponadtlenkowego ani nadtlenków, dlatego działają zapobiegawczo, a nie katalitycznie wobec utleniacza.

Trzecią klasą są enzymy wytwarzające utleniacze, przede wszystkim oksydazy NADPH. Granica między nimi a enzymami antyoksydacyjnymi nie zawsze jest ostra. Peroksyredoksyna 6 ma obok aktywności peroksydazy aktywność fosfolipazy A2, która u myszy jest potrzebna do uruchomienia oksydazy NADPH 2 w śródbłonku naczyń płucnych i w makrofagach pęcherzykowych [7]. O przynależności do klasy decyduje w takim przypadku funkcja domeny, która rozkłada nadtlenki.

1.4. Rys historyczny

Historia klasy zaczyna się od dwóch białek krwinki czerwonej, których funkcję poznano długo po ich opisaniu. W 1938 roku Mann i Keilin opisali w krwinkach czerwonych białko zawierające miedź, nazwane hemokupreiną, a później erytrokupreiną [8]. Przez około trzydzieści lat pozostawało ono białkiem miedziowym bez przypisanej funkcji [8]. W 1969 roku McCord i Fridovich wykryli aktywność, która hamowała tlenową redukcję cytochromu c przez oksydazę ksantynową, i ustalili, że pochodzi ona od erytrokupreiny [8, 9]. Białko to okazało się dysmutazą miedziowo-cynkową, a jego odkrycie zapoczątkowało biochemię wolnych rodników tlenowych [8].

Peroksydaza glutationowa przeszła podobną drogę od aktywności do cząsteczki. W 1957 roku Mills opisał w krwinkach czerwonych enzym, który z udziałem glutationu chroni hemoglobinę przed rozpadem oksydacyjnym [10]. Do lat siedemdziesiątych wpływ selenu na zdrowie zwierząt znano, ale nie łączono go z żadnym konkretnym białkiem. W 1973 roku Rotruck i współpracownicy stwierdzili u szczurów, że krwinki zwierząt z niedoborem selenu są praktycznie pozbawione aktywności tego enzymu, a oczyszczony enzym zawiera selen [11]. Ustalenie to wyjaśniło wiele żywieniowych skutków selenu jego rolą w peroksydazie glutationowej [11].

2. Cechy wspólne i mechanizm działania

2.1. Budowa enzymów antyoksydacyjnych

Przedstawicieli klasy łączy centrum aktywne, które łatwo oddaje i przyjmuje elektrony. W dysmutazach ponadtlenkowych i katalazie rolę tę pełni jon metalu. W peroksydazach tiolowych i reduktazach pełni ją reszta aminokwasu zawierająca siarkę albo selen.

Wszystkie trzy dysmutazy ponadtlenkowe wymagają do aktywności metalu katalitycznego, miedzi albo manganu [12]. W dysmutazie miedziowo-cynkowej reakcję przeprowadza miedź, a cynk występuje w ilości równomolowej do miedzi [8, 13]. Miedź trafia do enzymu z udziałem białka opiekuńczego CCS, czyli przenośnika miedzi przeznaczonego dla tej dysmutazy [13]. Katalaza zawiera żelazo związane w hemie, czyli w tym samym układzie porfirynowym co hemoglobina. Białka te tworzą oligomery: dysmutaza cytozolowa jest dimerem, a dysmutazy mitochondrialna i pozakomórkowa są tetramerami [1].

Peroksydazy tiolowe mają w centrum aktywnym resztę cysteiny albo selenocysteiny. Peroksyredoksyny zawdzięczają aktywność tak zwanej cysteinie nadtlenkowej, na którą przechodzi atom tlenu z nadtlenku [5]. Pięć z ośmiu peroksydaz glutationowych ssaków zawiera selenocysteinę, a trzy mają w tym miejscu cysteinę [6]. Reduktaza tioredoksyny ssaków jest selenoenzymem o dużej masie cząsteczkowej [2]. Reduktaza glutationowa i reduktaza tioredoksyny wiążą ponadto FAD, czyli dinukleotyd flawinoadeninowy pochodzący z ryboflawiny, który przekazuje elektrony z NADPH na mostek disiarczkowy.

Wspólna budowa ma bezpośrednią konsekwencję fizjologiczną. Aktywność całej klasy zależy od podaży miedzi, cynku, manganu, żelaza, selenu i ryboflawiny, więc stan odżywienia wpływa na nią przez kilka niezależnych dróg.

2.2. Wspólny mechanizm działania

Wspólnym zadaniem klasy jest doprowadzenie częściowo zredukowanego tlenu do wody bez uwalniania produktów pośrednich zdolnych do uszkodzeń. Stanem wyjściowym jest komórka, w której łańcuch oddechowy i oksydazy wytwarzają anionorodnik ponadtlenkowy. Pierwszy etap katalizują dysmutazy ponadtlenkowe, które z dwóch anionorodników tworzą cząsteczkę tlenu i cząsteczkę nadtlenku wodoru [14]. Reakcja przebiega w dwóch krokach na tym samym jonie metalu. Najpierw jeden anionorodnik oddaje elektron jonowi miedzi albo manganu i odchodzi jako tlen cząsteczkowy. Następnie zredukowany jon metalu oddaje elektron drugiemu anionorodnikowi, który po przyłączeniu dwóch protonów staje się nadtlenkiem wodoru. Dysmutaza miedziowo-cynkowa przeprowadza tę reakcję z szybkością bliską granicy wyznaczonej przez dyfuzję substratu [13].

Skutkiem pierwszego etapu jest zamiana rodnika na cząsteczkę mniej reaktywną, która może pełnić rolę sygnału [3]. Nadtlenek wodoru nadal jest jednak utleniaczem, więc drugi etap musi go usunąć. Komórka dysponuje do tego dwiema strategiami. Katalaza rozkłada dwie cząsteczki nadtlenku wodoru na wodę i tlen bez zewnętrznego reduktora. Peroksydazy redukują natomiast nadtlenek do wody elektronami pobranymi z glutationu albo tioredoksyny [2, 6].

W peroksyredoksynie proces składa się z trzech kroków. Nadtlenek wodoru utlenia cysteinę nadtlenkową do kwasu sulfenowego, który następnie tworzy mostek disiarczkowy z drugą resztą cysteiny [5]. Tioredoksyna rozrywa ten mostek i przywraca enzymowi postać zredukowaną [2]. W peroksydazie glutationowej dwie cząsteczki glutationu oddają elektrony i łączą się w disiarczek glutationu. Reduktaza glutationowa i reduktaza tioredoksyny odtwarzają następnie zredukowany glutation i tioredoksynę kosztem NADPH [2]. NADPH pochodzi głównie ze szlaku pentozofosforanowego, czyli bocznej drogi przemiany glukozy. Stąd cała gałąź peroksydazowa zależy ostatecznie od metabolizmu glukozy, a układ glutationu i układ tioredoksyny mogą się wzajemnie zastępować jako dawcy elektronów [2].

O tym, który enzym przechwyci nadtlenek wodoru, decyduje iloczyn stałej szybkości reakcji i stężenia białka oraz jego położenie w komórce [4]. Peroksyredoksyna 2 z ludzkich krwinek czerwonych reaguje z nadtlenkiem wodoru ze stałą szybkości 1,3 × 10⁷ M⁻¹ s⁻¹, około stukrotnie większą, niż zakładano [15]. W warunkach doświadczalnych przy pH 7,4 szybkość ta była porównywalna z szybkością reakcji katalazy [15]. Białka regulowane przez utlenienie reagują z nadtlenkiem wodoru ze stałymi rzędu 1–10 M⁻¹ s⁻¹, a peroksyredoksyny ze stałymi rzędu 10⁷–10⁸ M⁻¹ s⁻¹ [16]. Wynika z tego, że przy niskich stężeniach nadtlenek wodoru reaguje przede wszystkim z peroksyredoksynami, a bezpośrednie utlenienie białka sygnałowego jest mało prawdopodobne [16].

Sprzeczność między sprawnym usuwaniem nadtlenku wodoru a jego rolą sygnałową tłumaczą dwa modele. Hipoteza tak zwanej śluzy (ang. floodgate) wyszła od obserwacji, że peroksyredoksyny eukariotyczne są znacznie bardziej podatne na nadmierne utlenienie niż bakteryjne [17]. Autorzy zaproponowali, że przy wysokim stężeniu nadtlenku wodoru peroksyredoksyna ulega przejściowemu unieczynnieniu i przepuszcza sygnał, a w spoczynku utrzymuje stężenie niskie [17]. Nadmiernie utleniona cysteina tworzy kwas sulfinowy, który wcześniej uznawano za zmianę nieodwracalną. Sulfiredoksyna redukuje go jednak kosztem energii z adenozynotrifosforanu (ATP), co wykazano u drożdży dla białka zachowanego także u wyższych eukariontów [18]. Drugi model zakłada przekaźnik redoks, w którym utleniona peroksyredoksyna 2 przekazuje utlenienie na czynnik transkrypcyjny STAT3, czyli przekaźnik sygnału i aktywator transkrypcji 3, uruchamiany przez cytokiny [16]. Oba modele opierają się na doświadczeniach na białkach oczyszczonych i komórkach hodowanych, więc ich udział w sygnalizacji w tkankach człowieka pozostaje hipotezą. Nie wykluczają się one, a peroksyredoksyny mogą działać zarówno jako czujniki, jak i przekaźniki sygnału [19].

2.3. Źródło zróżnicowania w obrębie klasy

Zróżnicowanie w obrębie klasy ma trzy główne źródła: odrębne geny, sekwencje kierujące białko do przedziału komórki i sposób wbudowania pierwiastka katalitycznego. Poszczególne dysmutazy ponadtlenkowe są kodowane przez osobne geny o odmiennej budowie, ewolucji i regulacji ekspresji [1]. Dlatego ta sama reakcja zachodzi w każdym przedziale pod kontrolą innego genu, a uszkodzenie jednego z nich nie wyłącza pozostałych.

Drugim źródłem są sekwencje sygnałowe. Dysmutaza manganowa powstaje z peptydem liderowym, który kieruje ją do mitochondriów, a dysmutaza pozakomórkowa z peptydem sygnałowym, który prowadzi ją na zewnątrz komórki [1]. W rezultacie dysmutazy wytwarzają nadtlenek wodoru w tym przedziale, w którym działają, a lokalne stężenie tego sygnału zależy od ich rozmieszczenia [12].

Trzecim źródłem jest selenocysteina. Kodon UGA, który zwykle kończy syntezę białka, zostaje odczytany jako selenocysteina tylko wtedy, gdy w informacyjnym RNA znajduje się specjalna struktura wbudowania selenocysteiny, zwana SECIS [20]. Ludzki genom koduje w ten sposób 25 selenobiałek [20]. W rodzinie peroksydaz glutationowych obok izoform selenowych występują izoformy z cysteiną [6]. Niedobór selenu obniża więc aktywność tylko części przedstawicieli klasy, a pozostałe izoformy tej samej rodziny działają dalej [6].

Czwartym, pomocniczym źródłem są dodatkowe funkcje niektórych białek. Hipoteza zakłada na przykład udział peroksydaz glutationowych 7 i 8 w fałdowaniu białek, co wciąż czeka na potwierdzenie [6]. Ekspresję wielu enzymów klasy podnosi czynnik transkrypcyjny Nrf2 (czynnik jądrowy 2 pokrewny erytroidalnemu), który uruchamia zestaw genów ochronnych w odpowiedzi na utleniacze i związki elektrofilowe [21]. Zróżnicowanie to sprawia, że niedobory pierwiastków, warianty genów i choroby dotykają poszczególnych przedstawicieli w różnym stopniu.

3. Najważniejsze enzymy antyoksydacyjne

Osiem enzymów i rodzin enzymów tej klasy różni się metalem albo resztą aktywną, przedziałem komórkowym i sposobem odtwarzania. Cechy te decydują o tym, gdzie i jaki utleniacz dany enzym usuwa oraz od czego zależy jego aktywność.

Enzymy tej klasy dzielą się zatem na samowystarczalne i zależne od reduktora. Dysmutazy i katalaza wracają do stanu wyjściowego w samym cyklu katalitycznym, a wszystkie peroksydazy tiolowe zależą ostatecznie od NADPH dostarczanego przez reduktazy.

3.1. Dysmutaza ponadtlenkowa 1

Dysmutaza ponadtlenkowa 1 (ang. superoxide dismutase 1, SOD1) to cytozolowa dysmutaza miedziowo-cynkowa zbudowana z dwóch identycznych podjednostek [1, 14]. Występuje niemal wyłącznie we wnętrzu komórki, w cytoplazmie [1]. Miedź otrzymuje od białka opiekuńczego CCS, które powstało w ewolucji z pierwotnej dysmutazy, gdy ta utraciła własne miejsce wiązania miedzi [13]. Myszy całkowicie pozbawione SOD1 rozwijają się prawidłowo i do szóstego miesiąca życia nie mają widocznych zaburzeń ruchowych [22]. Ich neurony ruchowe giną jednak znacznie częściej po uszkodzeniu aksonu, więc enzym jest potrzebny głównie w warunkach obciążenia [22]. Odrębne znaczenie SOD1 wynika z tego, że mutacje jej genu są jedną z przyczyn rodzinnego stwardnienia zanikowego bocznego [14].

3.2. Dysmutaza ponadtlenkowa 2

Dysmutaza ponadtlenkowa 2 (SOD2) to dysmutaza manganowa działająca w macierzy mitochondriów. Powstaje w cytozolu jako prekursor z peptydem liderowym, który kieruje ją do mitochondrium [1]. Po przejściu przez błony i odcięciu peptydu tworzy w macierzy czynny tetramer [23]. Miejsce działania SOD2 pokrywa się z jednym ze źródeł anionorodnika ponadtlenkowego, łańcuchem oddechowym. U myszy wyłączenie genu SOD2 prowadzi do śmiertelnej kardiomiopatii [1]. Kontrast z prawidłowym rozwojem myszy bez SOD1 pokazuje, że dysmutazy z różnych przedziałów nie zastępują się nawzajem [1, 22].

3.3. Dysmutaza ponadtlenkowa 3

Dysmutaza ponadtlenkowa 3 (SOD3) to pozakomórkowa dysmutaza miedziowo-cynkowa zbudowana z czterech podjednostek [1]. Peptyd sygnałowy kieruje ją na zewnątrz komórki, gdzie usuwa anionorodnik ponadtlenkowy z przestrzeni pozakomórkowej, między innymi w ścianie naczyń [1, 12]. Chroni w ten sposób tlenek azotu wydzielany przez śródbłonek przed utlenieniem do nadtlenoazotynu [12]. U człowieka pojedyncza zamiana aminokwasu w SOD3 wiąże się z dziesięcio- do trzydziestokrotnym wzrostem jej stężenia w surowicy [1]. Odrębność SOD3 polega na tym, że działa w miejscu, do którego dysmutazy wewnątrzkomórkowe nie docierają.

3.4. Katalaza

Katalaza to enzym zawierający żelazo hemowe, który rozkłada nadtlenek wodoru na wodę i tlen. Działa głównie w peroksysomach, gdzie wiele oksydaz wytwarza nadtlenek wodoru jako produkt uboczny. Katalaza jest najdawniej poznanym enzymem antyoksydacyjnym i kluczowym ogniwem przemiany nadtlenku wodoru [24]. Od peroksydaz odróżnia ją to, że nie zużywa glutationu ani NADPH, więc jej działanie nie obciąża puli reduktorów komórki. Ekspresja i rozmieszczenie katalazy są wyraźnie zmienione w komórkach nowotworowych, co bada się jako możliwy punkt uchwytu terapii [24].

3.5. Peroksydazy glutationowe

Peroksydazy glutationowe (ang. glutathione peroxidases, GPx) to rodzina ośmiu enzymów ssaków, oznaczanych od GPx1 do GPx8 [6]. Izoformy GPx1–4 i GPx6 zawierają selenocysteinę, a GPx5, GPx7 i GPx8 cysteinę [6]. GPx1 działa w cytozolu, a GPx3 krąży w osoczu i wiąże się z błonami, co może tłumaczyć jej aktywność mimo niskiego stężenia glutationu w osoczu [6]. GPx4 redukuje wodoronadtlenki fosfolipidów bezpośrednio w błonach. Uczestniczy też w regulacji śmierci komórki oraz, razem z GPx5, w płodności męskiej [6]. Odrębność rodziny polega na zależności od selenu i glutationu jednocześnie.

3.6. Peroksyredoksyny

Peroksyredoksyny (ang. peroxiredoxins, PRDX) to rodzina sześciu peroksydaz tiolowych ssaków, oznaczanych od PRDX1 do PRDX6 [19]. Występują w komórkach w dużych ilościach i szybko usuwają nadtlenki [5]. Peroksyredoksyna 3 działa w mitochondriach, gdzie jej nadmierne utlenienie służy do miejscowej regulacji sygnału nadtlenku wodoru [19]. Peroksyredoksyna 6 ma aktywność peroksydazy glutationowej, czyli korzysta z glutationu zamiast z tioredoksyny [7]. Odrębność rodziny wynika z jej kinetyki, bo peroksyredoksyny są preferowanym celem nadtlenku wodoru nawet w obecności katalazy i peroksydazy glutationowej [15].

3.7. Tioredoksyna i reduktaza tioredoksyny

Układ tioredoksyny to zespół tioredoksyny, reduktazy tioredoksyny i NADPH, który redukuje mostki disiarczkowe w białkach [2]. Reduktaza tioredoksyny przenosi elektrony z NADPH na tioredoksynę, a ta przekazuje je peroksyredoksynom [2]. Tioredoksyna redukuje też reduktazę rybonukleotydów potrzebną do syntezy DNA i reduktazy sulfotlenku metioniny, które naprawiają utlenione białka [2]. Układ ten reguluje ponadto czynniki transkrypcyjne wrażliwe na stan redoks i wiąże się z białkiem TXNIP, czyli białkiem oddziałującym z tioredoksyną [2]. U ssaków działa odrębnie w cytozolu i w mitochondriach, a obie reduktazy są selenoenzymami [2]. Odrębność układu polega na tym, że obsługuje on znacznie szerszy krąg białek niż sama gałąź antyoksydacyjna.

3.8. Reduktaza glutationowa

Reduktaza glutationowa to flawoproteina, która odtwarza zredukowany glutation z disiarczku glutationu kosztem NADPH. Bez niej glutation utleniony przez peroksydazy glutationowe nie wracałby do puli aktywnej. Aktywność enzymu zależy od wysycenia FAD, dlatego współczynnik jej aktywacji w erytrocytach służy do oceny stanu odżywienia ryboflawiną [25]. Układ glutationu i układ tioredoksyny mogą w komórkach ssaków wzajemnie się zastępować jako dawcy elektronów [2]. Odrębność reduktazy glutationowej polega na tym, że jest wspólnym ogniwem dla wszystkich enzymów zużywających glutation.

4. Znaczenie kliniczne

4.1. Rola enzymów antyoksydacyjnych w fizjologii

W fizjologii enzymy antyoksydacyjne nie tylko chronią przed uszkodzeniem, lecz także nadają kształt sygnałom przekazywanym przez utleniacze. Pojęcie reaktywnych form tlenu obejmuje cząsteczki o bardzo różnych właściwościach, a ich działanie rozciąga się od sygnalizacji do uszkodzenia komórki [3]. Nadtlenek wodoru i anionorodnik ponadtlenkowy pełnią przy tym odmienne role i wymagają odrębnego opisu [3]. Enzymy tej klasy decydują o tym, który z nich i w jakim miejscu przeważa.

Przykładem roli sygnałowej jest peroksydaza glutationowa 1, która uczestniczy w regulacji sygnału insulinowego [6]. Myszy z nadekspresją GPx1 rozwinęły hiperglikemię i hiperinsulinemię, a zawartość tłuszczu w ich ciele wyniosła 37% wobec 17% u myszy kontrolnych [26]. U tych zwierząt zależna od insuliny fosforylacja receptora insulinowego i kinazy białkowej B, czyli kinazy Akt przekazującej sygnał insuliny w komórce, była o 30–70% słabsza [26]. Autorzy tłumaczą to nadmiernym wygaszaniem utleniaczy potrzebnych do uwrażliwienia komórki na insulinę [26]. Wynik dotyczy myszy z genetycznie zwiększoną ekspresją enzymu, dlatego jest modelem mechanizmu, a nie opisem fizjologii człowieka.

Peroksyredoksyny uczestniczą w sygnalizacji cytokinowej i w podziale komórki. W komórkach hodowanych pobudzenie cytokiną utleniało peroksyredoksynę 2 i czynnik transkrypcyjny STAT3, a przebieg tej sygnalizacji zależał od ilości peroksyredoksyny 2 [16]. Peroksyredoksyna 1 jest regulowana odwracalną fosforylacją w centrosomie, co wiąże jej aktywność z przebiegiem mitozy [19]. Z tych danych wynika, że aktywność enzymów antyoksydacyjnych wyznacza amplitudę i czas trwania sygnału nadtlenku wodoru, więc zaburza ją zarówno niedobór, jak i nadmiar enzymu.

4.2. Udział enzymów antyoksydacyjnych w chorobach

Enzymy antyoksydacyjne uczestniczą w chorobach dwiema drogami: przez mutacje zmieniające budowę białka i przez niedobór aktywności. Przykładem pierwszej drogi jest stwardnienie zanikowe boczne. Około 10% przypadków tej choroby ma charakter rodzinny i dziedziczy się autosomalnie dominująco, a w 1993 roku Rosen i współpracownicy znaleźli w genie SOD1 jedenaście różnych mutacji zmiany sensu w trzynastu rodzinach [14]. Mutacje SOD1 odpowiadają za około 20% rodzinnych przypadków choroby [27].

Mechanizm uszkodzenia neuronów ruchowych nie sprowadza się do braku aktywności dysmutazy, bo myszy bez SOD1 nie mają w pierwszych miesiącach życia ani objawów, ani zmian patologicznych w rdzeniu kręgowym [22, 27]. Model toksycznego zysku funkcji zakłada natomiast, że zmutowane białko nieprawidłowo się zwija i tworzy wtręty w cytoplazmie neuronów [27]. Nieprawidłowo zwiniętą SOD1 bez mutacji wykryto także w neuronach i komórkach glejowych chorych na postać sporadyczną [27]. Hipoteza, że białko to uczestniczy również w sporadycznym stwardnieniu zanikowym bocznym, pozostaje przedmiotem badań [27]. Konsekwencją tego modelu jest strategia leczenia, która obniża ilość SOD1 zamiast zwiększać jej aktywność.

Drugą drogę ilustrują dziedziczne niedobory enzymów. Akatalazemia to dziedziczny, niemal całkowity brak aktywności katalazy w krwinkach czerwonych [28]. Pierwotnie opisywano ją jako stan bezobjawowy [28]. U chorych z Japonii i Węgier nie stwierdzono jednak wyrównawczego wzrostu aktywności peroksydazy glutationowej we krwi [28]. Odkażanie roztworem nadtlenku wodoru w czasie znieczulenia wywołało u japońskiego pacjenta z akatalazemią ciężką methemoglobinemię [28]. Podobne ryzyko methemoglobinemii i hemolizy dotyczy leczenia rasburykazą, która wytwarza nadtlenek wodoru podczas rozkładu kwasu moczowego [28]. Cukrzyca występowała u 18,5% osób z dziedzicznym niedoborem katalazy i ujawniała się około dziesięć lat wcześniej niż w populacji [28]. Autorzy przeglądu łączą ten związek z oksydacyjnym uszkodzeniem wrażliwych na utleniacze komórek beta trzustki, co pozostaje hipotezą [28].

Dziedziczny niedobór reduktazy glutationowej znaleziono tylko w dwóch przypadkach na ponad 15 000 zbadanych próbek krwi [29]. W opisanej rodzinie objawiał się fawizmem, czyli hemolizą po spożyciu bobu, oraz zaćmą, a u innego pacjenta ciężką żółtaczką noworodkową [29]. Krwinki czerwone tych chorych nie miały aktywności enzymu, więc nie mogły odtwarzać glutationu zużytego w reakcjach z utleniaczami [29]. W liniach komórek nowotworowych hamowanie peroksydazy glutationowej 4 wywołuje ferroptozę, czyli śmierć komórki zależną od żelaza i utlenionych lipidów [30].

Częste warianty genów enzymów antyoksydacyjnych wiążą się z ryzykiem chorób słabo i niespójnie. Wariant Ala16Val genu SOD2, czyli zamiana alaniny na walinę w pozycji 16, zmienia sekwencję kierującą enzym do mitochondrium. In vitro prekursor z alaniną dawał o 30–40% więcej czynnego enzymu w macierzy niż prekursor z waliną [23]. W metaanalizie 42 badań wariant ten wiązał się z rakiem prostaty ilorazem szans 1,08 przy 95-procentowym przedziale ufności 1,01–1,15, czyli szansami większymi o około 8% [31]. W metaanalizie 14 badań nie wiązał się ze stanem przedrzucawkowym w żadnym modelu genetycznym [32]. Wariant Pro198Leu genu GPX1, czyli zamiana proliny na leucynę w pozycji 198, wiązał się z nowotworami ogółem ilorazem szans 1,09 w metaanalizie 60 badań [33]. W metaanalizie dotyczącej raka prostaty nie znalazł się natomiast wśród wariantów istotnych [31]. Efekty te są małe, a ich powtarzalność między chorobami i populacjami jest słaba.

4.3. Punkty uchwytu leków i innych substancji

Punkty uchwytu leków w tej klasie są trzy: obniżenie ilości szkodliwego białka, naśladowanie aktywności enzymu i dostarczenie pierwiastka potrzebnego do jego syntezy. Tofersen to oligonukleotyd antysensowny podawany dokanałowo, który zmniejsza syntezę białka SOD1 [34]. W badaniu z randomizacją VALOR u 108 chorych z mutacją SOD1 obniżył stężenie SOD1 w płynie mózgowo-rdzeniowym i lekkich łańcuchów neurofilamentów w osoczu [34]. Nie poprawił jednak po 28 tygodniach głównego punktu końcowego, czyli wyniku skali sprawności funkcjonalnej u chorych z szybszym postępem choroby. Różnica wobec placebo wyniosła 1,2 punktu przy p = 0,97 [34]. Po 52 tygodniach chorzy, którzy zaczęli leczenie wcześniej, mieli wynik lepszy o 3,5 punktu niż chorzy z późniejszym startem, ale analiza ta nie była korygowana na wielokrotne porównania [34]. Poważne neurologiczne działania niepożądane wystąpiły u 7% leczonych [34].

Drugi punkt uchwytu wykorzystują mimetyki enzymów, czyli małe cząsteczki o aktywności katalitycznej podobnej do enzymu. Awasopasem manganu to badany mimetyk dysmutazy ponadtlenkowej [35]. W badaniu III fazy z randomizacją ROMAN u 455 chorych na raka głowy i szyi, leczonych radioterapią z cisplatyną, zmniejszył w analizie głównej częstość ciężkiego zapalenia błony śluzowej jamy ustnej z 64% do 54% [36]. Mediana czasu trwania tego powikłania skróciła się z 18 do 8 dni [36]. Poprawa głównego punktu końcowego była mniejsza, niż przewidywało badanie II fazy [36]. Amerykańska Agencja Żywności i Leków uznała stosunek korzyści do ryzyka za niewystarczający i zażądała kolejnego badania potwierdzającego [36]. Ebselen jest najszerzej badanym mimetykiem peroksydazy glutationowej, także w kilku badaniach klinicznych [37]. Nie wykazywał istotnej toksyczności, ale ma umiarkowaną aktywność katalityczną i bardzo słabo rozpuszcza się w wodzie [37].

Trzeci punkt uchwytu dotyczy selenu, składnika selenocysteiny w peroksydazach glutationowych. W badaniu z randomizacją SELECT u 35 533 mężczyzn selen nie zmniejszył ryzyka raka prostaty, a współczynnik ryzyka wyniósł 1,04 [38]. Przegląd Cochrane dziesięciu badań z randomizacją nie wykazał wpływu suplementacji selenu na zachorowalność na nowotwory, z ryzykiem względnym 1,01 przy wysokiej pewności danych [39]. W tych badaniach suplementacja wiązała się z nieco wyższym ryzykiem cukrzycy typu 2, a w SELECT także z łysieniem i zapaleniem skóry [39]. W SELECT u mężczyzn z najwyższym wyjściowym stężeniem selenu suplementacja zwiększała też ryzyko raka prostaty o wysokim stopniu złośliwości [39]. Badania obserwacyjne wiązały wyższe narażenie na selen z mniejszą zachorowalnością na nowotwory, ale pewność tych danych oceniono jako bardzo niską [39].

4.4. Wsparcie suplementacyjne

Aktywność enzymów antyoksydacyjnych zależy od kofaktorów dostarczanych z pożywieniem, więc część substancji wpływa na nią bezpośrednio. W badaniu z randomizacją u 98 osób z niskim spożyciem selenu aktywność peroksydazy glutationowej w osoczu osiągała plateau już przy najmniejszej podaży dodatkowej [40]. Aktywność peroksydazy w osoczu reaguje zatem na selen tylko w zakresie niedoboru, a pełne wysycenie selenoproteiny P wymagało większej podaży [40]. W przeglądzie systematycznym 18 badań współczynnik aktywacji reduktazy glutationowej w erytrocytach (EGRAC) i jej aktywność podstawowa zmieniały się pod wpływem podaży ryboflawiny [25]. W badaniu kontrolowanym u 47 kobiet podaż manganu zwiększyła aktywność dysmutazy manganowej w limfocytach [41]. W metaanalizie 17 badań z randomizacją koenzym Q10 zwiększył umiarkowanie aktywność dysmutazy ponadtlenkowej, bez istotnego wpływu na katalazę i peroksydazę glutationową [42].

Dla selenu, ryboflawiny i manganu wzrost aktywności odpowiada uzupełnieniu kofaktora, więc jego zakres wyznacza stan wyjściowy [25, 40, 41]. Dla koenzymu Q10 metaanaliza nie określa mechanizmu wpływu na dysmutazę [42]. Miedź i cynk są kofaktorami dysmutaz, ale w przeglądzie systematycznym aktywność dysmutazy w erytrocytach nie reagowała na zmiany stanu miedzi na tyle, by służyć jako jego wskaźnik [43]. Dawkowanie i interakcje tych substancji opisują karty działu Suplementy.

5. Na co warto zwrócić uwagę

Aktywność dysmutazy, katalazy i peroksydazy glutationowej można oznaczyć w krwinkach i w osoczu, ale wynik odpowiada na węższe pytanie, niż się zwykle zakłada [40, 43]. Niska aktywność dysmutazy w krwinkach nie dowodzi niedoboru miedzi, bo w przeglądzie 16 małych badań z udziałem 288 osób parametr ten nie odzwierciedlał stanu miedzi [43]. Aktywność peroksydazy glutationowej w osoczu przestaje rosnąć przy stosunkowo niewielkiej podaży selenu, więc prawidłowy wynik nie świadczy o pełnej ekspresji wszystkich selenobiałek [40]. Współczynnik aktywacji reduktazy glutationowej jest miarą stanu odżywienia ryboflawiną, a nie ogólnej wydolności obrony antyoksydacyjnej [25]. Krwinki czerwone nie mają mitochondriów, więc pomiar w nich nie informuje o aktywności enzymów w mitochondriach neuronów czy komórek mięśnia sercowego. Autorzy stanowiska ekspertów biologii redoks postulują precyzyjny pomiar poszczególnych utleniaczy i ich celów sygnałowych zamiast ogólnych wskaźników [3]. Pojedyncza aktywność enzymu we krwi nie opisuje zatem stanu redoks całego organizmu. Wynik takiego oznaczenia nie jest rozpoznaniem choroby.

Preparaty z dysmutazą ponadtlenkową budzą wątpliwości z powodu drogi podania. Dysmutaza jest białkiem, które w przewodzie pokarmowym podlega trawieniu jak inne białka pokarmowe. U myszy dodatek dysmutazy do paszy nie zmienił aktywności dysmutazy miedziowo-cynkowej ani manganowej w jelicie, wątrobie, nerkach i krwi [44]. Preparaty łączące dysmutazę z melona z gliadyną pszenną mają chronić enzym przed trawieniem. W badaniu na myszach, prowadzonym przez producenta, połączenie to chroniło zwierzęta przed prozapalnym działaniem interferonu gamma, czego nie robił sam wyciąg z melona [45]. Przegląd danych zwierzęcych i klinicznych ocenił ten preparat jako możliwe leczenie uzupełniające i wskazał potrzebę dużych badań klinicznych [46].

Założenie, że więcej enzymu antyoksydacyjnego oznacza lepszą ochronę, nie znajduje oparcia w danych. Zwierzęta z nadmiarem peroksydazy glutationowej 1 rozwijały insulinooporność, co pokazuje, że wygaszenie sygnału nadtlenku wodoru ma koszt metaboliczny [26]. Obniżanie ilości SOD1 tofersenem jest z kolei celem leczenia, a nie zagrożeniem, bo szkodzi zmutowane białko, a nie brak jego aktywności [27, 34]. Badania z randomizacją nad selenem wskazują, że dostarczanie tego kofaktora nie zmniejsza zachorowalności na nowotwory, a hipoteza korzyści u osób z niskim stężeniem selenu nie została potwierdzona [39].

Genotypowanie wariantów SOD2 i GPX1 nie daje informacji o sprawności enzymów antyoksydacyjnych u konkretnej osoby. Iloraz szans rzędu 1,1 opisuje niewielkie przesunięcie ryzyka w dużej populacji, a nie prognozę dla jednej osoby [31, 33]. Wynik genotypowania nie jest zatem podstawą do oceny ryzyka u konkretnej osoby ani do decyzji o suplementacji. Decyzje dotyczące leczenia stwardnienia zanikowego bocznego i stosowania selenu w chorobie podejmuje się w porozumieniu z lekarzem.