Antyoksydanty

1. Charakterystyka antyoksydantów

1.1. Definicja antyoksydantów

Antyoksydant to związek, który w stężeniu znacznie niższym od stężenia substratu utlenialnego istotnie opóźnia albo hamuje jego utlenienie. Definicja ta ma dwa elementy i oba są potrzebne. Element pierwszy, czyli przewaga stężeniowa substratu, oddziela antyoksydanty od zwykłych reduktorów: związek działający dopiero w stężeniu porównywalnym z chronioną cząsteczką nie pełni tej roli w warunkach komórkowych. Element drugi, czyli opóźnienie utleniania, wskazuje na skutek, a nie na budowę.

Warunkiem przynależności do klasy jest zachowanie po oddaniu elektronu. Każdy związek oddający elektron rodnikowi sam staje się rodnikiem, wobec czego o przydatności rozstrzyga to, co dzieje się dalej [3]. Rodnik tokoferylowy powstający z witaminy E jest trwały, ponieważ niesparowany elektron rozkłada się na pierścień aromatyczny, i przez to nie atakuje sąsiednich kwasów tłuszczowych. Rodnik powstający z cząsteczki bez takiej stabilizacji przedłużałby reakcję łańcuchową zamiast ją przerywać, czyli działałby odwrotnie do zamierzonego skutku.

Klasa jest czynnościowa, a nie chemiczna, i to odróżnia ją od większości grup opisywanych w encyklopedii. Należą do niej białka enzymatyczne, tripeptyd, witaminy rozpuszczalne w wodzie i w tłuszczach, barwniki roślinne, chinon oraz związki wiążące jony metali. Łączy je wyłącznie skutek działania, a dzieli wszystko pozostałe: budowa, miejsce występowania, mechanizm i wydajność [1].

Trzy pojęcia sąsiadujące bywają z antyoksydantami mylone. Reduktor oddaje elektrony bez warunku stabilizacji własnego rodnika, wobec czego nie każdy reduktor chroni przed utlenianiem. Chelator metali nie oddaje elektronów wcale, tylko wiąże żelazo i miedź, uniemożliwiając im rozkład nadtlenku wodoru do rodnika hydroksylowego. Aktywator odpowiedzi antyoksydacyjnej, na przykład związek siarkowy z warzyw kapustnych, sam nie wiąże rodników, lecz podnosi ekspresję enzymów obronnych przez szlak Nrf2 [13]. Rozgraniczenie ma znaczenie praktyczne, gdyż związki z ostatniej grupy bywają opisywane jako przeciwutleniacze, choć działają mechanizmem przeciwnym, czyli łagodnym obciążeniem utleniającym.

Osobne hasło jest uzasadnione tym, że nazwa „antyoksydant” łączy obiekty o odmiennej wydajności i odmiennym miejscu działania, a wnioskowanie z jednego przedstawiciela o całej klasie jest źródłem najczęstszych błędów w piśmiennictwie popularnym.

1.2. Podział antyoksydantów i kryteria klasyfikacji

Klasę dzieli się według czterech niezależnych kryteriów, a każde odpowiada na inne pytanie i daje inny podział.

Podział według mechanizmu jest najbardziej pouczający, ponieważ pokazuje trzy odrębne strategie obrony. Związki zapobiegawcze działają przed powstaniem rodnika: ferrytyna i transferyna wiążą jony żelaza, a dysmutazy usuwają anion ponadtlenkowy, zanim uszkodzi centra żelazowo-siarkowe [1]. Związki przerywające łańcuch działają w trakcie reakcji: witamina E przechwytuje rodnik nadtlenkowy w błonie i zatrzymuje propagację. Układy naprawcze działają po fakcie, przywracając pierwotną postać utlenionym białkom i kwasom nukleinowym.

Podziału tych nie da się na siebie nałożyć, ponieważ ten sam związek zajmuje w każdym z nich inne miejsce. Koenzym Q10 jest nieenzymatyczny, lipidowy, przerywający łańcuch i endogenny naraz, natomiast dysmutaza ponadtlenkowa jest enzymatyczna, wodna, zapobiegawcza i endogenna. Wobec tego pytanie o to, który antyoksydant jest „najlepszy”, nie ma odpowiedzi bez wskazania miejsca i rodzaju zagrożenia.

1.3. Rys historyczny

Do końca lat sześćdziesiątych XX wieku obronę przed utlenianiem uznawano za zjawisko czysto chemiczne, oparte na przypadkowym wiązaniu rodników przez związki obecne w tkance. Odkrycie dysmutazy ponadtlenkowej przez Josepha McCorda i Irwina Fridovicha w 1969 roku ten pogląd obaliło, ponieważ pokazało, że organizm ma enzym przeznaczony wyłącznie do usuwania utleniacza, a więc obronę zorganizowaną.

Drugie rozstrzygnięcie dotyczyło uporządkowania klasy. Garry Buettner wykazał w 1993 roku, że reakcje między antyoksydantami układają się według jednoelektronowych potencjałów redoks w przewidywalną kolejność, nazwaną hierarchią dziobania [3]. Przedtem sądzono, że poszczególne związki działają niezależnie i zamiennie. Po tym rozstrzygnięciu obraz zmienił się na kaskadę, w której uszkodzenie jest przekazywane od cząsteczki o wyższym potencjale do cząsteczki o niższym, aż do NADPH.

Trzecie rozstrzygnięcie przyszło z badań klinicznych i dotyczyło samej hipotezy antyoksydacyjnej. Przegląd Cochrane z 2012 roku, obejmujący badania z randomizacją u ponad dwustu tysięcy uczestników, wykazał brak korzyści z suplementacji, a dla beta-karotenu i witaminy E wzrost śmiertelności całkowitej [21]. Przedtem powszechnie zakładano, że podaż przeciwutleniaczy przełoży się na zmniejszenie zapadalności na choroby przewlekłe. Po tym rozstrzygnięciu badania przesunęły się z podaży związków niskocząsteczkowych na pobudzanie własnych układów obronnych komórki.

2. Cechy i mechanizm działania antyoksydantów

2.1. Cecha wspólna antyoksydantów

Przedstawicieli klasy łączy jedna właściwość chemiczna: zdolność oddania elektronu albo atomu wodoru przy niskim koszcie własnym. Koszt ten mierzy się tym, jak reaktywny pozostaje związek po oddaniu elektronu.

Mechanizm stabilizacji jest w obrębie klasy powtarzalny. Pierścień aromatyczny w witaminie E, układ podwójnych wiązań w karotenoidach, pierścień chinonowy w koenzymie Q10 oraz podwójne wiązanie w askorbinianie pełnią tę samą rolę: rozkładają niesparowany elektron na kilka atomów i obniżają jego reaktywność. Skutkiem jest rodnik na tyle trwały, że dożyje spotkania z kolejnym antyoksydantem, zamiast zaatakować najbliższą cząsteczkę.

Enzymy osiągają ten sam cel inaczej. Zamiast oddawać własne elektrony, przeprowadzają reakcję między dwiema cząsteczkami substratu albo przenoszą elektrony z zewnętrznego dawcy. Dysmutaza ponadtlenkowa łączy dwie cząsteczki ponadtlenku w nadtlenek wodoru i tlen, a peroksydazy przenoszą elektrony z glutationu albo z tioredoksyny na nadtlenek [4]. Wobec tego enzym nie zużywa się w reakcji, a jego zdolność obronna zależy od podaży dawcy elektronów, nie od własnego stężenia.

2.2. Mechanizm działania

Kluczem do zrozumienia całej klasy jest to, że jej przedstawiciele nie działają równolegle, tylko szeregowo, a kolejność wyznaczają potencjały redoks [3].

Sekwencję najlepiej widać w błonie komórkowej. Rodnik nadtlenkowy lipidu ma wysoki potencjał utleniający i atakuje sąsiedni kwas tłuszczowy, przedłużając reakcję łańcuchową. Witamina E, osadzona w błonie swoim łańcuchem węglowodorowym, oddaje temu rodnikowi atom wodoru i przerywa łańcuch. Powstały rodnik tokoferylowy ma potencjał niższy, przez co nie atakuje lipidów, natomiast zostaje zredukowany przez askorbinian z fazy wodnej po wewnętrznej stronie błony. Rodnik askorbylowy, o potencjale jeszcze niższym, oddaje uszkodzenie glutationowi, a glutation zostaje odtworzony przez reduktazę kosztem NADPH.

Skutkiem tej organizacji jest przeniesienie uszkodzenia z miejsca wrażliwego do miejsca, w którym daje się je naprawić energią metaboliczną. Elektron zużyty na naprawę błony pochodzi ostatecznie z glukozy przetworzonej w szlaku pentozofosforanowym, a każda cząsteczka witaminy E może w ten sposób przerwać wiele łańcuchów, o ile kaskada za nią działa. Wynika stąd wniosek praktyczny: podaż jednego ogniwa nie poprawia obrony, gdy ogniwo dalsze jest niesprawne.

Drugim wspólnym mechanizmem, obok kaskady, jest rozdzielenie zadań między układy o odmiennej kinetyce. Peroksyredoksyny i peroksydazy glutationowe mają wysokie powinowactwo i usuwają nadtlenek wodoru przy stężeniach nanomolowych, natomiast katalaza ma powinowactwo niskie i przejmuje pracę przy stężeniach wysokich [4]. Komórka zyskuje w ten sposób obronę działającą w szerokim zakresie stężeń bez utraty czułości w zakresie sygnałowym.

2.3. Źródło zróżnicowania w obrębie klasy antyoksydantów

Przedstawiciele klasy różnią się na czterech osiach, a każda różnica ma następstwo praktyczne.

Osią pierwszą jest rozpuszczalność, wyznaczająca dostępny przedział. Witamina E i koenzym Q10 pozostają w fazie lipidowej błon i lipoprotein, a witamina C, glutation i kwas moczowy w fazie wodnej cytozolu i osocza. Rodzaj uszkodzenia, przed którym związek chroni, wynika wprost z tego podziału, ponieważ cząsteczka nie chroni przedziału, do którego nie dociera.

Osią drugą jest potencjał redoks, wyznaczający miejsce w kaskadzie [3]. Związek o potencjale wyższym niż jego sąsiad nie odbierze od niego uszkodzenia, wobec czego kolejność nie jest dowolna, tylko wymuszona termodynamicznie.

Osią trzecią jest sposób zużycia. Związek niskocząsteczkowy działa stechiometrycznie, czyli jedna cząsteczka wiąże jeden albo dwa rodniki i wymaga odtworzenia. Enzym działa katalitycznie i przetwarza tysiące cząsteczek substratu na sekundę. Różnica ta sięga kilku rzędów wielkości i tłumaczy, dlaczego ubytek selenu unieruchamiający peroksydazy waży dla komórki więcej niż zmiana podaży witaminy C [10].

Osią czwartą jest odtwarzalność. Glutation, tioredoksyna, witamina C i koenzym Q10 mają własne enzymy odtwarzające, przez co ich pula krąży w obiegu. Karotenoidy takiego układu nie mają i po utlenieniu są rozkładane. Konsekwencją jest odmienna zależność od podaży: pula związków odtwarzalnych zależy głównie od sprawności reduktaz, a pula pozostałych od dostarczania z pożywieniem.

3. Najważniejsze antyoksydanty

Poniższe zestawienie obejmuje przedstawicieli o udokumentowanej roli w komórce ludzkiej, uporządkowanych według natury chemicznej i miejsca działania. Kolumna mechanizmu podaje reakcję, którą związek wykonuje, a nie ogólną etykietę „wiąże wolne rodniki”.

Enzymy pierwszej linii obejmują dysmutazy, katalazę, peroksydazy glutationowe i peroksyredoksyny. Ich wspólną cechą jest działanie katalityczne, a różnicą zakres stężeń, w którym pracują. Peroksyredoksyny wychwytują nadtlenek wodoru przy stężeniach sygnałowych i przenoszą informację o jego obecności na białka docelowe, natomiast katalaza usuwa go przy stężeniach, przy których sygnalizacja już nie działa [4].

Glutation jest największą pulą tiolową komórki i zarazem dawcą elektronów dla peroksydaz i transferaz [11, 12]. Jego rola polega na zaopatrywaniu enzymów, nie na samodzielnym wiązaniu rodników, i to rozróżnienie jest w piśmiennictwie popularnym najczęściej gubione.

Witamina C działa w fazie wodnej i odtwarza rodnik tokoferylowy na granicy faz. Jej stężenie w osoczu wysyca się przy podaży rzędu dwustu miligramów na dobę, ponieważ wchłanianie zachodzi przez transporter o ograniczonej przepustowości, a nadmiar jest wydalany z moczem [14, 15]. Dalsze zwiększanie podaży nie podnosi zatem stężenia tkankowego, co ogranicza sens dawek wysokich w podaży doustnej.

Witamina E jest głównym związkiem przerywającym łańcuch peroksydacji w błonach. Jej działanie zależy od obecności askorbinianu, bez którego rodnik tokoferylowy gromadzi się i przy wysokich stężeniach sam staje się utleniaczem. Zależność ta tłumaczy niepowodzenie prób z izolowaną podażą witaminy E w dużych dawkach [21, 22].

Koenzym Q10 pełni dwie role naraz: przenosi elektrony w łańcuchu oddechowym i chroni lipidy błon w postaci zredukowanej, czyli ubichinolu [16]. Odtwarzanie tej postaci przy błonie komórkowej zapewnia białko FSP1, które w 2019 roku rozpoznano jako drugi, niezależny od glutationu układ obrony przed ferroptozą [7, 8]. Trzecim układem tej samej rodziny jest dehydrogenaza dihydroorotanowa w mitochondrium, wykorzystywana przez komórki nowotworowe do przeżycia mimo zahamowania peroksydazy glutationowej 4 [9].

Karotenoidy wygaszają tlen singletowy skuteczniej niż pozostali przedstawiciele, ponieważ przyjmują energię wzbudzenia bez przeniesienia elektronu. Ich odrębność polega też na braku układu odtwarzającego, przez co pula zależy wyłącznie od podaży.

Kwas moczowy odpowiada u człowieka za znaczną część zdolności antyoksydacyjnej osocza, co ma następstwo pomiarowe: oznaczenia zbiorcze tej zdolności odzwierciedlają głównie jego stężenie [28]. Dwuznaczność tego związku polega na tym, że jego wysokie stężenie jest równocześnie czynnikiem ryzyka dny moczanowej i chorób sercowo-naczyniowych.

Polifenole zajmują w tej klasie miejsce osobne. Ich zdolność wiązania rodników zmierzona w probówce jest wysoka, choć stężenia osiągane w osoczu po spożyciu pozostają zbyt niskie, żeby tłumaczyć obserwowane działanie [17, 18]. Obecne wyjaśnienie wskazuje na pobudzanie własnych mechanizmów komórki: modyfikację szlaku Nrf2, wpływ na szlaki sygnałowe oraz działanie miejscowe w nabłonku jelita, gdzie stężenia są wysokie [19, 20].

4. Znaczenie kliniczne antyoksydantów

4.1. Rola antyoksydantów w fizjologii

Zadaniem układu antyoksydacyjnego nie jest usunięcie wszystkich utleniaczy, tylko utrzymanie ich stężenia w zakresie, w którym przenoszą sygnał, nie powodując uszkodzeń [1, 2]. Ta różnica celu jest w całym haśle najważniejsza, ponieważ zmienia pożądany kierunek każdej interwencji.

Pierwszą funkcją klasy jest ochrona struktur o ograniczonej zdolności naprawy. Błony bogate w wielonienasycone kwasy tłuszczowe, DNA mitochondrialne i białka o długim czasie życia należą do struktur, w których uszkodzenie kumuluje się szybciej, niż zostaje naprawione.

Drugą funkcją jest umożliwienie sygnalizacji redoks. Peroksyredoksyny usuwają nadtlenek wodoru tak szybko, że tworzą wokół źródła gradient stężenia, dzięki czemu sygnał pozostaje miejscowy [4]. Bez sprawnego usuwania nie byłoby ani wygaszania sygnału, ani jego przestrzennego ograniczenia.

Trzecią funkcją jest udział w regulacji odpowiedzi przystosowawczej. Szlak Nrf2 podnosi ekspresję kilkuset genów obejmujących enzymy tej klasy w odpowiedzi na łagodne obciążenie, przez co układ obronny dopasowuje się do obciążenia [13].

4.2. Udział antyoksydantów w chorobach

Niedobory składników wchodzących w skład enzymów dają obrazy chorobowe o wyraźnym mechanizmie. Niedobór selenu unieruchamia peroksydazy glutationowe i w skrajnych postaciach wiąże się z kardiomiopatią opisaną w rejonach o ubogiej w selen glebie [10]. Niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej pozbawia erytrocyt NADPH, przez co po ekspozycji utleniającej dochodzi do hemolizy mimo prawidłowego stężenia glutationu.

Zaburzenia obrony przed peroksydacją lipidów prowadzą do ferroptozy. Utrata aktywności peroksydazy glutationowej 4 albo wyczerpanie glutationu uruchamiają niekontrolowaną reakcję łańcuchową w błonach, a układy FSP1 i dehydrogenazy dihydroorotanowej stanowią wobec niej zabezpieczenie równoległe [5, 6, 7, 9]. Mechanizm ten wiąże się z uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym, chorobami neurozwyrodnieniowymi i uszkodzeniem nerek.

W nowotworach zależność się odwraca. Komórki nowotworowe podnoszą aktywność układów antyoksydacyjnych, dzięki czemu przeżywają w warunkach utleniających i uodporniają się na leczenie działające przez wywoływanie uszkodzeń [9, 27]. Wysoka aktywność szlaku Nrf2 w guzie jest z tego powodu cechą niekorzystną rokowniczo, a hamowanie peroksydazy glutationowej 4 oraz FSP1 badane jest jako podejście terapeutyczne [7, 9].

4.3. Punkty uchwytu leków i substancji

Punkty uchwytu dzielą się na trzy grupy według tego, w którym miejscu układu działają.

Grupa pierwsza dostarcza substratu. N-acetylocysteina uzupełnia pulę cysteiny i przez to zwiększa syntezę glutationu, co ma ustaloną wartość w zatruciu paracetamolem, natomiast w pozostałych wskazaniach opiera się na danych niejednorodnych. Glicyna podawana razem z nią uzupełnia drugi substrat syntezy.

Grupa druga działa przez ekspresję enzymów. Fumaran dimetylu, zarejestrowany w stwardnieniu rozsianym i w łuszczycy, modyfikuje reszty cysteinowe białka Keap1 i uruchamia szlak Nrf2, przez co podnosi ekspresję enzymów obronnych [13]. Ten sam punkt uchwytu mają izotiocyjaniany pochodzenia roślinnego, przy znacznie słabszej dokumentacji klinicznej.

Grupa trzecia hamuje układ celowo. Inhibitory peroksydazy glutationowej 4 i FSP1 badane są jako leki przeciwnowotworowe, ponieważ uwrażliwiają komórki guza na ferroptozę [7, 9]. Kierunek działania jest w tej grupie odwrotny do potocznego wyobrażenia o przeciwutleniaczach i pokazuje, że cel terapeutyczny zależy od kontekstu.

4.4. Czynniki wpływające na stężenia antyoksydantów

Podaż pierwiastków śladowych wyznacza aktywność enzymów niezależnie od ich ekspresji. Selen wchodzi w skład peroksydaz glutationowych, miedź i cynk w skład dysmutazy cytozolowej, mangan w skład dysmutazy mitochondrialnej, a żelazo w skład katalazy. Niedobór któregokolwiek unieruchamia odpowiedni enzym, czego nie może wyrównać nadmiar pozostałych składników [10].

Podaż związków niskocząsteczkowych z dietą wyznacza pulę antyoksydantów egzogennych. Witamina C, witamina E i karotenoidy pochodzą wyłącznie z pożywienia, natomiast ich stężenia w osoczu wysycają się przy umiarkowanej podaży [14, 15]. Dalsze zwiększanie dawki podnosi wydalanie, nie stężenie tkankowe.

Zużycie wyznacza tempo ubytku. Przewlekłe zapalenie, ekspozycja na ksenobiotyki wymagające sprzęgania, palenie tytoniu oraz intensywny wysiłek zwiększają zapotrzebowanie. Przy niezmienionej podaży pula wtedy spada, a stosunek postaci zredukowanych do utlenionych przesuwa się w stronę utlenienia.

Osobnym czynnikiem jest podaż dużych dawek przeciwutleniaczy w postaci suplementu. Obniża ona sygnał redoks towarzyszący wysiłkowi, a wraz z nim część przystosowań mięśnia szkieletowego do treningu [26]. Może zatem przynosić szkodliwe skutki. Oznacza to, że układ antyoksydacyjny funkcjonuje na zasadzie homeostazy – dąży do wartości docelowej w określonym optymalnym zakresie, a nie do stałego maksimum.

5. Na co zwrócić uwagę

Najczęstszym nieporozumieniem jest traktowanie antyoksydantów jako jednorodnej grupy o wspólnym działaniu. Dysmutaza ponadtlenkowa, witamina E i polifenol z herbaty różnią się przedziałem, mechanizmem, wydajnością i zależnością od podaży, wobec czego wniosek wyprowadzony z jednego z nich nie przenosi się na pozostałych [1, 3]. Zdanie o „działaniu antyoksydacyjnym” bez wskazania przedstawiciela i miejsca działania nie niesie informacji sprawdzalnej.

Drugie zastrzeżenie dotyczy oznaczeń zdolności antyoksydacyjnej. Wartość mierzona w probówce, na przykład metodą ORAC, opisuje reakcję z rodnikiem wzorcowym w warunkach nieodpowiadających komórce, a dla osocza ludzkiego w znacznej części odzwierciedla stężenie kwasu moczowego i albuminy [28]. Wynik wysoki bywa zatem następstwem hiperurykemii, czyli stanu samego w sobie niekorzystnego, a zestawienia produktów spożywczych według tej wartości nie mają odniesienia do działania w organizmie [17, 20].

Trzecie zastrzeżenie dotyczy dowodów z badań klinicznych. Suplementacja witaminą E i beta-karotenem nie zmniejszyła liczby zdarzeń sercowo-naczyniowych w metaanalizie badań z randomizacją [23], przegląd Cochrane wskazał wzrost śmiertelności całkowitej [21], a analiza zależności od dawki ten kierunek potwierdziła [22]. Mapa dowodów dla mikroskładników w zapobieganiu chorobom sercowo-naczyniowym umieściła obie substancje wśród interwencji bez korzyści albo szkodliwych [24]. W zapobieganiu rakowi gruczołu krokowego suplementacja selenem i witaminą E również korzyści nie przyniosła [25].

Czwarte zastrzeżenie dotyczy interakcji z leczeniem przeciwnowotworowym. Część leków przeciwnowotworowych i radioterapia działają przez wywołanie uszkodzeń utleniających, wobec czego równoczesna podaż dużych dawek przeciwutleniaczy budzi wątpliwość co do skuteczności leczenia [27]. Dane pochodzą z badań niejednorodnych i nie pozwalają na jednoznaczne rozstrzygnięcie, zarazem sam mechanizm jest wystarczającą podstawą do ostrożności.

Piąte zastrzeżenie dotyczy polifenoli. Ich korzystne działanie w badaniach obserwacyjnych jest opisane szeroko, choć wyjaśnienie oparte na bezpośrednim wiązaniu rodników nie utrzymuje się wobec danych o stężeniach osiąganych w osoczu [17, 18]. Obecne wyjaśnienie odwołuje się do pobudzania własnych mechanizmów obronnych komórki oraz do działania miejscowego w jelicie [19, 20]. Różnica ta jest istotna, gdyż wniosek o dawce i postaci preparatu wygląda odmiennie w każdym z tych dwóch ujęć.

Szóste zastrzeżenie dotyczy przenoszenia wyników. Znaczna część mechanizmów obrony przed peroksydacją lipidów została ustalona w liniach komórkowych i w modelach zwierzęcych, w tym rozstrzygnięcia dotyczące FSP1 i dehydrogenazy dihydroorotanowej [7, 8, 9]. Dane o ich znaczeniu w tkankach ludzkich pozostają nieliczne, a odniesienie tych mechanizmów do wyboru suplementu jest w obecnym stanie wiedzy nieuprawnione.